牦牛曲拉源乳酸菌的產香性能比較

文鵬程，曹 磊，楊 敏，馬瑞娟，張忠明，張衛兵,*

（1.甘肅農業大學食品科學與工程學院，甘肅 蘭州 730070；2.甘肅農業大學理學院，甘肅 蘭州 730070）

發酵乳中的風味物質形成主要歸因于發酵劑的作用，發酵劑中乳酸菌發酵產生的風味物質是發酵乳典型特征風味的基礎，發酵劑中乳酸菌菌株的質量與活力對發酵乳的風味和品質影響較大[1-2]。牦牛曲拉是將牦牛乳脫脂后，在自然條件下進行發酵使酪蛋白凝結、干燥后制成的一種發酵乳制品[3-5]。牦牛曲拉不僅可以食用，還可作為制作酸奶的發酵劑，其中蘊藏著豐富的乳酸菌資源[6]。實驗室前期從牦牛曲拉中篩選得到了幾株發酵性能優良的乳酸菌，但對其產香性能尚不明確。

固相微萃?。╯olid phase microextraction，SPME）技術具有靈敏度高、檢出限低、分析范圍廣、萃取條件溫和等特點，可直接與氣相色譜-質譜（gas chromatographymass spectrometry，GC-MS）聯用[7-9]。近年來，SPME-GC-MS技術在食品風味分析中有了快速發展，其在醋[10]、紅酒[11]、果蔬[12]、綠茶[13]等相關研究中的應用越來越廣泛。

本實驗以牦牛曲拉源乳酸菌為研究對象，利用SPME-GC-MS檢測分析發酵乳中揮發性風味物質，采用相對氣味活度值（relative odor activity value，ROAV）探討分析發酵乳中的關鍵性風味物質，并利用主成分分析法對其產香性能進行比較，以期為青藏高原乳酸菌資源的利用開發提供參考依據。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

脫脂乳粉 黑龍江完達山乳業；MRS瓊脂培養基、MRS肉湯培養基 青島海博生物技術有限公司。

乳酸菌菌株：Q1嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus），Q2耐久腸球菌（Enterococcus durans），G1、G2、G3、G4瑞士乳桿菌（Lactobacillus helveticus）由甘肅農業大學食品科學與工程學院實驗室保藏。

1.2 儀器與設備

SW-CJH-2FD型超凈工作臺 蘇州凈化設備有限公司；YX-280A型高壓滅菌鍋 上海三申醫療器械有限公司；HG303-4型電熱恒溫培養箱 上海一恒科學儀器有限公司；TRACE1310-ISQ型GC-MS聯用儀 美國Thermo Scientific公司；DVB/CAR/PDMS型萃取頭 美國Supelco公司。

1.3 方法

1.3.1 發酵酸乳樣品的制備

參照萬金敏[14]的方法。發酵酸乳的制作流程：原料乳→檢驗→標準化→巴氏殺菌（90 ℃，5 min）→加糖→均質（6 8～7 2 ℃，二級均質1.5×1 04、5×103kPa）→接種（乳基發酵劑添加量為3%）→發酵（42 ℃，4～7 h）→降溫→后發酵（4 ℃，24 h）→成品。

1.3.2 揮發性風味物質測定

萃取條件：取8 mL樣品于頂空瓶并加入2 g NaCl，密封并搖勻。50 ℃平衡60 min，萃取頭于50 ℃水浴鍋中磁力攪拌吸附30 min；萃取頭在250 ℃老化1 h；250 ℃解吸附3 min。

GC條件：HP-5毛細管柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；采用程序升溫方式，起始溫度35 ℃，保持5 min，以5 ℃/min上升至140 ℃，保持2 min，以10 ℃/min上升至250 ℃，保持3 min；汽化室溫度250 ℃；載氣為He，流速1.0 mL/min；不分流進樣。

MS條件：電子電離源；電子能量70 eV；燈絲電流0.20 mA；離子源溫度230 ℃；質量掃描范圍m/z 40～500；發射電流100 μA。

1.3.3 定性與定量分析

揮發性成分利用MS全離子掃描模式下的總離子流圖譜，以NIST08標準庫自動檢索獲得各組分的質譜數據，通過峰面積歸一化法計算各組分相對峰面積的百分含量。每份樣品取樣3 次，取平均值作為各風味物質組分的相對含量。

1.3.4 關鍵揮發性物質評價

參照劉登勇等[15]的方法，用ROAV法確定樣品中關鍵揮發性風味物質。先定義對樣品風味貢獻最大的組分為ROAVmax=100，其他風味成分ROAV計算公式如下：

式中：Ci和Ti分別為各揮發性物質的相對含量/%和對應的感覺閾值/（μg/L）；Cmax和Tmax分別為對樣品總體風味貢獻最大組分的相對含量/%和對應的感覺閾值/（μg/L）。

所有組分的ROAV不大于100，而且ROAV越大的組分對樣品總體風味的貢獻也越大。一般認為ROAV不小于1的組分為所測樣品的關鍵風味化合物，0.1≤ROAV＜1的組分對所測樣品的總體風味具有重要修飾作用[16]。

1.4 數據處理

采用Microsoft Excel 2010和SPSS 18.0（SPSS Inc.,USA）數據處理系統進行分析，采用ANOVA進行方差分析，用Duncan法進行多重顯著性分析和標準偏差計算，利用Origin 8.0軟件進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單菌發酵乳中揮發性風味物質檢測分析

利用SPME-GC-MS技術對6 株不同的乳酸菌發酵過程中產生的風味物質進行檢測，得到揮發性成分的總離子流圖，將每份樣品取樣3 次測定后，發現獲得的總離子流圖大體相同，結果如圖1所示。

圖1 乳酸菌發酵乳中揮發性成分總離子流圖Fig. 1 Total ion current (TIC) chromatograms of volatiles extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

表1 單菌發酵牛乳樣品中揮發性風味物質SPME-GC-MS分析Table 1 Major volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures by SPME-GC-MS

使用NIST08譜庫檢索得到發酵乳揮發性風味物質的組成和含量，結果如表1所示。篩選并除去一部分硅氧烷類雜質峰，6 株乳酸菌發酵共產生60 種揮發性物質，不同菌種發酵產生的風味物質組成和含量存在差異。由表1可知，發酵乳樣品中的風味物質主要以酸、酮、醛和酯類物質為主，6 株菌發酵均產生2-庚酮、2-壬酮、2-十三酮、正丁酸、異戊醇、糠醇、乙偶姻、乙酸、己酸、癸酸和辛酸，且風味物質含量存在差異。菌株G1產2-庚酮能力顯著高于其余菌株（P＜0.05），而在其余菌株之間含量差異不顯著（P＞0.05）；菌株G1和Q1產生異戊醇與己酸能力強，顯著高于其余菌株（P＜0.05）；菌株G2產乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力顯著高于其他菌株（P＜0.05）；菌株G4產乙酸和丁酸能力較強。

另由表1可知，4 株桿菌發酵均產生己醛，而在球菌發酵的樣品中未檢出，且菌株G1產己醛能力高于其他菌株；只在球菌發酵的樣品中檢測出2,3-戊二酮，且相對含量差異不顯著（P＞0.05）。另外，乙基苯、正戊酸和萘為G1發酵產生的特有物質；雙戊烯、麥芽醇、2-糠酸甲酯、二羥基丙酮為G2發酵產生的特有成分；間二甲苯為G3所特有的成分；G4發酵產生丙酸和2-丁酮；Q2發酵可產生棕櫚酸。

王偉君等[17]研究發現，嗜熱鏈球菌發酵產生的風味物質主要包括2,3-戊二酮和2,3-丁二酮，這與本研究的結果相似。雷華威等[18]研究發現瑞士乳桿菌發酵產生的風味物質中酸類物質占最高比重，與本實驗結果一致，原因是本研究的瑞士乳酸菌的產酸能力較強。王丹等[1]研究嗜熱鏈球菌發酵酸乳，結果發現在嗜熱鏈球菌發酵時沒有產生乙醛，與本實驗結果一致。而Chaves等[19]發現嗜熱鏈球菌具有較強的產乙醛的能力，這可能與不同來源的菌株間的代謝差異性有關。綜上所述，不同乳酸菌發酵產生的代謝物質存在差異，因而導致發酵酸乳的風味物質組成有差異。

表2 單菌發酵牛乳中各類揮發性物質數量Table 2 Compositions and contents of volatile compounds extracted from fermented milk produced with pure cultures

由表2可知，菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2發酵分別產生了29、36、30、32、25、27 種揮發性風味物質，其中，菌株G2和G4發酵的牛乳產生風味物質較多，風味物質組成不同及各組分相對含量的不同體現出菌株之間的差異性。酸類物質相對含量在31.18%～76.13%之間，對發酵乳風味的形成具有巨大貢獻；酮和醇類物質在2.13%～13.49%范圍內，相對含量較高。其余揮發性物質的含量較少，但對形成發酵乳的總體風味依然具有重要作用。王丹等[1]認為發酵乳中復雜多樣的揮發性物質賦予發酵乳獨特風味，而不同類型的乳酸菌產生這些風味物質的能力存在差異，這與本實驗結果一致。在后續實驗中不同乳酸菌的代謝差異性可以通過轉錄組、代謝組學的方法進一步深入研究。

圖2 單菌發酵牛乳樣品中揮發性風味物質相對含量熱圖Fig. 2 Heatmaps of volatile flavor substances in fermented milk samples produced with pure cultures

發酵乳樣品中檢測出的羧酸類化合物較多，對酸乳的風味影響很大，酸類物質用于食品中可有效預防雜菌繁殖，賦予食品微酸味而又不掩蓋本身所具有的天然風味和香氣。乳酸菌發酵產生較多的酮類和較少的醛類物質。酮類風味物質主要來源于多不飽和脂肪酸的氧化和微生物自身的代謝等[20-21]；雖然檢測到的醛類物質組分相對較少，但醛類物質閾值整體相對較小，對風味影響巨大[22]。另外，本實驗乳酸菌發酵產生少量的酯和內酯及醇類物質。內酯類化合物具有極低的閾值，因此對發酵酸乳風味貢獻巨大[23]，酯類主要來源于微生物通過自身代謝產生和一部分脂肪酸水解形成，通過這些作用形成內酯和甲基酮等物質對發酵乳風味有重要影響[20]；雖然乳酸菌發酵產生了少量的醇類物質，但醇類物質閾值基本都很高，因此，其對整體風味影響極小，只有在較高濃度下才對風味產生影響[24]。

由圖2可以看出，所有乳酸菌產生風味物質的組成及含量存在差異。根據熱圖中組成及含量的聚類分析可知，菌株G3和Q2發酵產生的風味物質含量和組成相似，可將其聚為一類，說明這兩株菌的產香性能大致相似。另外，菌株Q1與菌株G3和Q2發酵產生的風味物質組成及含量接近。菌株G4與其余菌株發酵產生風味物質的差異最大，距離最遠。因此，不同乳酸菌菌株產生風味物質組成及含量差異較大，說明了乳酸菌種間的差異性，其產香能力存在差異。

2.2 不同發酵乳中關鍵風味化合物的ROAV分析

表3 單菌發酵牛乳中關鍵性風味物質及對應ROAVTable 3 ROAVs of key aroma compounds in fermented milk produced with pure cultures

為進一步確定不同乳酸菌產香性能的差異，采用ROAV法對所發酵產生的風味物質組成和含量結合其感覺閾值進行完善分析，確定其中的關鍵性風味物質。如表3所示，對未查詢到閾值的物質不作分析。6 株乳酸菌菌種發酵的酸乳中，發酵酸乳樣品中關鍵性風味物質存在差異，說明不同乳酸菌的產香性能不同。菌株G1、G2、G3、G4、Q1、Q2發酵酸乳的關鍵性風味物質分別為10、11、9、8、10、7 種。

酸類物質中辛酸、丁酸和己酸為關鍵性風味物質（ROAV≥1），辛酸具有水果酸味和淡酸味[25]，乙酸能夠呈現出醋酸的味道，丁酸有奶酪的味道[20,26]。其中，丁酸的ROAV在4.88～79.06范圍內，在酸類物質中對風味的貢獻大，在菌種G4和G1發酵樣品中ROAV分別達到79.06和57.79，說明丁酸是這2 株菌發酵乳的關鍵性風味物質。酮類物質中有3 種關鍵性風味物質，分別為2-庚酮、乙偶姻和2-壬酮，2-庚酮具有藥香氣味[25]、乙偶姻具有奶香和強烈的奶油味[27]、2-壬酮具有奶香氣味[28]。其中，2-壬酮的ROAV在47.16～100區間內，對風味貢獻巨大，在G1和Q2菌株發酵的樣品中ROAV分別為100和88.64，因此，這2 株菌產生的2-壬酮能夠賦予發酵乳特殊的風味。另外，菌株G2發酵乳中乙偶姻的ROAV為72.34，為關鍵性風味物質，2-庚酮在菌株G1中發揮較大作用，其ROAV為11.26。

醇類物質中異戊醇和糠醇為所有菌株發酵產生的醇類關鍵性風味物質。異戊醇在菌株G1和Q1發酵乳中是關鍵性風味物質（ROAV≥1），在其余菌株發酵的酸乳中對風味具有修飾作用（0.1≤ROAV＜1）?？反贾辉诰闓2發酵的酸乳中是關鍵風味物質，對風味貢獻較大；壬醛、己醛和乙醛是醛類物質中關鍵性風味物質（ROAV≥1），壬醛具有蠟香和脂肪香[29]、乙醛可賦予發酵乳清爽的芳香味[30]。其中，壬醛和己醛是菌株G1發酵產生的關鍵性風味物質，其ROAV分別為81.56和56.74，對酸乳的風味貢獻較大。乙醛是菌株G2、G3和Q2發酵酸乳的關鍵性風味物質。酯類物質中己酸乙酯是菌株G1、G2、Q1的關鍵性風味物質，其ROAV分別為30.14、24.82和53.19，對風味的形成影響較大。

2.3 發酵乳中關鍵性風味物質的主成分分析

表4 主成分特征值及方差貢獻率Table 4 Eigenvalues of principal components and their variance contribution rates

利用主成分分析研究ROAV大于0.1的風味物質，提取不小于1的主成分特征值，結果如表4所示。前3 個主成分的累計方差貢獻率為79.36%。

圖3 發酵牛乳關鍵揮發性風味物質主成分載荷圖Fig. 3 Principal component analysis loading plots of key volatile compounds of fermented milk produced with pure cultures

由圖3可知，第1、2、3主成分的方差貢獻率分別為38.70%、21.27%和19.39%。其中，主成分1中載荷最高的正影響揮發性風味物質為苯乙醇，與主成分1呈高度負相關的揮發性風味物質為乙酸；主成分2中載荷最高的正相關揮發性風味物質為丁位辛內酯，呈高度負相關的揮發性物質為乙醛；主成分3中載荷最高的正相關揮發性風味物質為己醛，呈高度負相關的發揮性風味物質為癸酸。上述結果說明苯乙醇、乙酸、丁位辛內酯、乙醛、己醛和癸酸是不同菌株發酵產生風味物質含量有顯著差異的揮發性物質。

圖4 發酵牛乳樣品主成分得分圖（A）和聚類圖（B）Fig. 4 Principal component analysis score plot (A) and clustering diagram (B) of fermented milk

由圖4A可知，主成分1很好地將G4和其他菌株區分開，菌株G4發酵樣品在主成分1的負半軸；菌株G1發酵樣品在主成分2的正半軸，主成分2可以將其與其他菌株完全區分開。從圖4觀察到6 株乳酸菌發酵乳分別位于圖中的4 個象限，表明PCA可以將不同菌株的產香能力完全分開，對其進行有效區分。由圖4B可知，菌株G3和Q2距離最為較近，聚為一類，與其余菌株距離較遠。G4和G1與其余菌株的距離最遠，這一結果與圖2分析結果一致。

3 結 論

采用SPME-GC-MS技術從6 株牦牛曲拉源乳酸菌的發酵乳中共鑒定出60 種揮發性風味物質，ROAV分析表明不同乳酸菌菌株發酵產生的關鍵性風味物質的組成及含量存在明顯差異。菌株的產香能力比較結果表明，菌株G1產生2-庚酮能力顯著高于其余菌株；菌株G1和Q1產生異戊醇與己酸能力強；菌株G2產乙偶姻、糠醇和2-十三酮能力顯著高于其他菌株；菌株G4產乙酸和丁酸能力較強。主成分分析結果也說明不同乳酸菌的產香性能存在差異。