卟啉及其卟啉基聚合物光動力學的比較研究

劉長玲，杜昌明，肖 翠，宋 巖

(1.吉林化工學院 材料科學與工程學院，吉林 吉林 132022；2.中油吉林石化公司 研究院，吉林 吉林 132022)

光動力療法(Photodynamic Therapy，PDT)是不同于手術、放療、化療和免疫治療的一種嶄新療法，對血管增生性病變組織的選擇性治療具有很好的療效[1-5].目前，PDT已成為腫瘤防治科學中研究最為活躍的療法之一[6].PDT的優點是適用范圍廣，能夠同時治療多種腫瘤，毒副作用低、生物相容性好，治療48～72 h即可出現療效，并且發病率低.[7-8]卟啉作為PDT的一種光敏劑，能夠選擇性的滯留在腫瘤組織內，在相應波長的光照射下，由基態躍遷到激發態，與周圍的分子氧發生光化學反應，產生的單線態氧(1O2)能夠破壞腫瘤細胞中的蛋白、脂質、核酸等重要的生物大分子，導致腫瘤細胞壞死凋亡，達到治療目的[9-10].

因此，對5-(4-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉及其卟啉基聚合物的光動力學療法進行比較研究，利用MTT法研究三種卟啉化合物對小鼠成纖維細胞(L929細胞)和人宮頸癌細胞(HeLa細胞)的暗毒性和光毒性.

1 實驗部分

5-(4-羥基苯基)-10,15,20-三苯基卟啉(Por)、卟啉端基化的聚(N-異丙基丙烯酰胺)(Por-PNIPAM)、卟啉端基化的聚N-異丙基丙烯酰胺-b-聚(寡聚乙二醇甲醚甲基丙烯酸酯)共聚物(Por-PNIPAM-b-POEGMA)已制備.

MTT(噻唑蘭)溶液的制備：稱取0.5 g的MTT，將其溶于100 mL的緩沖溶液(PBS)或無酚紅的培養基中，再用0.22 μm的濾膜過濾除菌，配制成濃度為5 mg/mL的MTT溶液，并在4 ℃下避光保存.

胎牛血清(FBS)的滅活：取一瓶血清在室溫下融化，再取一個相同體積的試劑瓶，瓶內裝滿涼水，靜置30～60 min，當兩個試劑瓶溫度接近時，同時放入到56 ℃的水浴中滅活1 h，隨后冷卻至室溫，再以100 mL/瓶進行分裝，在-20 ℃下貯存.

胰蛋白酶溶液的制備：取0.25 g的胰蛋白酶，加入到100 mL PBS中，充分攪拌溶解，靜置1.5 h后，在冰箱中放置一夜，用0.22 μm的濾膜過濾，除去細菌，在-20 ℃下保存備用.

2 結果與討論

2.1 卟啉及其卟啉聚合物的生物相容性

采用MTT法測試了不同濃度的Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液對L929以及HeLa的暗毒性.測試結果如圖1和圖2所示.

Concentration(mg/mL)圖1 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對小鼠成纖維細胞L929的暗毒性

Concentration(mg/mL)圖2 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對人宮頸癌細胞HeLa的暗毒性

圖1是Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對L929的暗毒性，結果表明卟啉化合物的濃度在0.05～0.25 mg/mL范圍內，隨著濃度的增大，細胞的存活率仍然很高，即使濃度高達0.25 mg/mL時，Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對L929細胞存活率也接近100%，說明在非光照的條件下它們對L929細胞幾乎沒有毒性.

圖2為Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在沒有光照射的情況下對HeLa細胞活性的影響，測試結果顯示了對于HeLa細胞的毒性也較低，細胞存活率都在90%以上，這說明了它們在黑暗的環境下，無論是人體正常的L929細胞，還是HeLa癌細胞的生物學相容性都很好.

2.2 卟啉及其卟啉聚合物的光毒性

同樣采用MTT法在5 W紅光照射下對L929和HeLa細胞毒性進行了測試.圖3為Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液處理的L929細胞的光毒性.從圖中可以看出，經Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA處理的L929細胞的存活率降低，與Por、Por-PNIPAM相比，Por-PNIPAM-b-POEGMA處理的L929細胞的存活率相對較低.原因可能是Por、Por-PNIPAM在37 ℃的水溶液中易發生π-π堆疊而淬滅導致細胞的光毒性降低.

Concentration(mg/mL)圖3 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對L929細胞的光毒性

Concentration(mg/mL)圖4 Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA對HeLa細胞的光毒性

圖4是Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在光照的情況下對HeLa細胞活性的影響.從圖4可以得出，經Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA處理的HeLa細胞的存活率較低，尤其Por-PNIPAM-b-POEGMA對于HeLa細胞的存活率降低至30%左右，Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液與Por、Por-PNIPAM相比較少發生淬滅，如圖5卟啉基聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA在光照條件下，對正常細胞L929和HeLa癌細胞的存活率進行比較，結果可知經過處理后L929的存活率僅降至70%，對HeLa癌細胞的存活率可降至30%左右，由此可見其對HeLa細胞的光毒性更大，而對正常細胞光毒性較小.

Concentration(mg/mL)圖5 Por-PNIPAM-b-POEGMA(Mn,GPC=5 900)對L929、HeLa細胞的光毒性

圖6(a)是在紅光照射的條件下，L929細胞在聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA水溶液中的光學照片，從圖中可以看出，大部分細胞貼壁生長，只有少量細胞死亡.圖6(b)是在可見光照射條件下，癌細胞(Hela細胞)在聚合物水溶液中的光學照片.

(a) L929細胞

(b) HeLa細胞圖6 細胞在聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA(Mn,GPC=5 900)水溶液(0.2 mg·mL-1)中的光學照片

從圖中可以看出，細胞干癟，幾乎全部死亡.這說明在光照的情況下，聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA對癌細胞有光毒性，能夠有效的殺傷癌細胞Hela，可以作為光敏劑用于PDT，而聚合物Por-PNIPAM-b-POEGMA對正常細胞幾乎沒有光毒性，是一種理想的光敏劑.

圖7是HeLa細胞在不同分子量的聚合物水溶液中的存活率，從圖中可以看出，高分子量的聚合物對HeLa細胞的光毒性比分子量低的聚合物低得多.出現這一現象的原因是聚合物一般沒有任何細胞毒性，而產物的光毒性主要來自于卟啉分子，在分子量較高的Por-PNIPAM-b-POEGMA中，卟啉分子的含量較低，因而光毒性也相對較弱.

Concentration(mg/mL)圖7 Por-PNIPAM43-b-POEGMA10和Por-PNIPAM43-b-POEGMA7共聚物對HeLa細胞存活率曲線

3 結 論

實驗所得結論如下：Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA在沒有光照的條件下，對正常細胞L929和癌細胞HeLa都具有較低的毒性，說明它們具有較好的生物相容性.在光照條件下，Por-PNIPAM-b-POEGMA比Por、Por-PNIPAM的細胞毒性強，Por、Por-PNIPAM、Por-PNIPAM-b-POEGMA分別對L929的毒性弱于對Hela的毒性.分子量高的Por-PNIPAM-b-POEGMA的光毒性更低.