聚乙烯亞胺聚合物點的制備及其在利福平檢測中的應用

劉眾虎，徐 娜

(吉林化工學院 材料科學與工程學院，吉林 吉林 132022)

利福平(RIF)對于治療肺結核和麻風病是具有良好療效的藥物,它也能用于抵抗葡萄球菌、流感嗜血桿菌以及艾滋病相關性鳥型分支桿菌等病原體.由于其對于防止結核病具有重要作用.利福平分別對肺結核宿主細胞內(nèi)外結合分歧桿菌和對需氧革蘭陽性菌具有明顯的殺菌及抗菌等重要作用，使其成為目前市場需求量最大的藥物之一.然而RIF還具有一定的毒副作用,它比其他防治結核病的藥物更易發(fā)生黃疸[1],這是由于其引起肝內(nèi)膽汁潴留、對肝細胞的毒副作用和過敏反應引起的,此外RIF還會促使肺結核病灶癌變或使已存在的癌組織繁殖加速.

目前,國內(nèi)外已知的檢測RIF含量的方法包括電化學法[2]、高效液相色譜法[3-5]以及紫外分光光度法等,但這幾種傳統(tǒng)檢測RIF的方法都具有較為明顯的缺點,如高效液相色譜法,在檢測RIF的過程中受液相試劑純度影響較大,液相試劑的靈敏度不高,穩(wěn)定性較差的缺點造成測量結果誤差較大,除此之外其他方法也存在操作繁瑣,耗時較長等缺點,因此建立一種快速,靈敏且準確的選特異性檢測利福平的方法,具有非常重要的實際意義.

熒光碳點是一種新型熒光納米材料,具有無毒、良好的生物相容性等優(yōu)異性能,在生物標記、生物成像、光催化及熒光探針等領域具有非常廣泛的應用前景[6-9].碳點的合成方法有水熱法[10]、燃燒法、微波法等.其中水熱法具有操作簡單、可控性強、可修飾等優(yōu)點,有利于大量生產(chǎn).

使用聚乙烯亞胺通過水熱法合成PEI聚合物碳點,將其作為熒光探針分子去檢測RIF,聚乙烯亞胺功能化碳量子點的氨基可以捕獲利福平分子,形成絡合物使其淬滅,并用該方法對于RIF的檢測限,線性范圍和選擇性等進行初步討論.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚乙烯亞胺(PEI,M=10 000)購買于阿拉丁公司,檸檬酸鈉(Na3C6H5O7·5H2O)購買于阿拉丁公司，其余實驗試劑：氯化鈉(NaCl)、氯化鉀(KCl)、氯化鎂(MgCl)、氯化銅(CuCl2)、氯化鋅(ZnCl2)、硝酸鉀(KNO3)、碳酸鈉(NaCO3)、硫酸鈉(NaSO4)、磷酸鈉(NaPO4),均購買于天津市永大化學試劑有限公司,氨基酸(Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg、Phe、Gly、Gln、Glu、Thr、Trp、Ser、Ala、Asp、Lys、Leu、Asn、Tyr、His)均取自北京鼎國長勝生物科技有限公司(中國北京).所有試劑均為分析純.

熒光光譜采用 F97XP熒光分光光度計測定，波長范圍:200～900 nm，波長精準度:±0．4 nm，(上海棱光)．紫外可見光譜用UV-2200雙單色器雙光束紫外可見分光光度計測定，波長范圍:190～1 100 nm，波長精準度:±0.25 nm，(北京瑞利儀器)．

1.2 實驗過程

1.2.1 PDs的制備

根據(jù)文獻[11]稍加改進,將1 g的檸檬酸鈉和0.5 g的PEI(M=10 000)溶在25 mL的燒杯中,加入10 mL的水,攪拌均勻后,放入反應釜中在160 ℃的情況下水熱8 h,所得的淡黃色溶液就是制備的聚乙烯亞胺聚合物點(PDs).

1.2.2 PDs對RIF的檢測

在對PDs的檢測時,選取在總體積為2 mL的水中加入10 μL的PDs(250 μM),均勻混合后,分別加入不同濃度RIF(0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、7.5、15、25、50 μM)，待孵育1 min之后，

固定激發(fā)波長350 nm，測試其熒光光譜.

1.2.3 PDs對于RIF的選擇性檢測

將PDs溶液(250 μM)溶在2 mL的水中,在其中分別加入同種濃度的不同陰陽離子(如Na+、K+、Cl-、NO3-等各100 μM)及常見氨基酸(如Val、Met、Cys、Ile、Pro、Arg等各100 μM)孵育1 min后,測定PDs的選擇特異性.

2 結果與討論

2.1 PDs的表征

如圖1(a)所示,是聚合物點的紫外可見吸收光譜圖,在紫外波長為300～350 nm之間出現(xiàn)了一個較為明顯的吸收峰,在400～500 nm之間并沒與出現(xiàn)新的吸收峰,這說明溶液中不存在較大的納米顆粒,所以推測形成了聚乙烯亞胺聚合物點.由圖1(b)的熒光光譜表征可知,聚合物點的最大激發(fā)光譜和發(fā)射光譜分別為350 nm和440 nm,兩者之間存在較大的斯托克斯位移,這使得PDs的發(fā)射光譜不受其激發(fā)波長的影響,說明該聚合物點具有良好的抗干擾性,可以作為性能良好的熒光探針.

Wavelength/nm(a)聚合物點的紫外可見吸收光譜

Wavelength/nm(b)聚合物點的激發(fā)光譜(350 nm)和發(fā)射光譜(440 nm)圖1 聚合物點(a)吸收及(b)熒光光譜圖

2.2 PDs對RIF的檢測性能分析

由圖2可以看出,未加入PDs時,溶液中的熒光強度較高,在加入PDs之后,熒光強度下降,這就說明該聚合物點具有使熒光淬滅的能力,在孵育時間為1～10 min的過程中,每隔1 min取一個樣進行對比檢測,發(fā)現(xiàn)孵育1 min和10 min的結果相同,這就說明在孵育1 min之后熒光強度就已經(jīng)趨于穩(wěn)定，可以進行檢測,也體現(xiàn)出了PDs具有快速檢測的能力.

Wavelength/nm圖2 加入PDs后的響應時間圖

Wavelength/nm(a)聚合物點溶液中加入不同濃度的RIF后的熒光強度圖

CRIF/μM(b)不同濃度的RIF之后熒光強度關系圖圖3 圖3熒光響應圖

在一定濃度的PDs中加入不同濃度的RIF溶液,(0、0.1、0.2、0.5、1、2、3、5、7.5、15、25、50 μM),待孵育1 min之后放入熒光光度計進行分析,如圖3(a)所示,在425nm為波長的熒光光譜中,在未加入RIF溶液時,PDs熒光強度較強,隨著RIF濃度的增加，熒光強度隨之減弱,由此我們可以得出RIF有著使PDs熒光猝滅的能力.圖3(b)是加入RIF前后的熒光強度差值與利福平濃度的關系圖,,其線性范圍是0～7.5 μM，檢測限為0.1 μmol/L.

2.3 PDs對RIF的選擇性

(a)聚合物點中加入常見陰陽離子前后的熒光比率圖

(b)常見氨基酸熒光檢測前后對比圖圖4 抗干擾檢測

2.4 檢測機理研究

檢測機理研究見圖5.

Wavelength/nm圖5 PEI(黑色),RIF(紅色),PEI-RIF復合物(藍色)的紫外可見吸收光譜圖

對PDs對RIF的檢測機理行進了研究，圖5是PEI、RIF、PEI-PDs的紫外可見吸收光譜圖,可以看出,PDS在紫外可見光下沒有明顯吸收峰,在PDs中加入RIF之后吸收峰出現(xiàn)了明顯變化,可能兩者之間形成了新的官能團,這些吸收光譜的明顯變化表明在利福平檢測過程中形成了一種非熒光基態(tài)復合物，最終導致PDs的熒光猝滅.

3 結 論

以檸檬酸鈉和聚乙烯亞胺為原料,通過水熱法合成了具備良好穩(wěn)定性的氨基聚合物點(PDs)熒光材料,可對利福平進行特異性檢測.利福平可以與PDs形成一種非熒光基態(tài)復合物,從而使PDs熒光淬滅.在優(yōu)化實驗條件后,開發(fā)了一種優(yōu)異的熒光傳感系統(tǒng),用于檢測利福平.PDs是基于熒光的傳感系統(tǒng)具有快速檢測,靈敏度高,選擇性好,線性響應范圍寬,成本低等優(yōu)點,在檢測利福平方面具有廣闊的應用前景.