聚合物點/金納米簇比率熒光探針的合成及其對三聚氰胺檢測的應用

劉夢旋，孟 磊

(1.吉林化工學院 材料科學與工程學院，吉林 吉林 132022;2.吉林化工學院 理學院，吉林 吉林 132022)

三聚氰胺(Melamine)，又名：密胺、氰脲三酰胺、三聚氰酰胺.化學名稱為1,3,5-三嗪-2,4,6-三胺.三聚氰胺是一種重要的氮雜環有機化工原料，與甲醛縮合聚合可制得三聚氰胺樹脂，這種樹脂被廣泛運用于木材、塑料、造紙、紡織、皮革等行業；三聚氰胺還可以作阻燃劑、減水劑、甲醛清潔劑等[1-2].由于食品和飼料工業蛋白質含量測試方法的缺陷，而三聚氰胺又無味不易發現，所以常被不法商人用作食品添加劑，以提升食品檢測中的蛋白質含量指標.蛋白質主要由氨基酸組成,含氮量一般不超過30%，而三聚氰胺的分子式含氮量為66%左右.通用的蛋白質測試方法“凱氏定氮法”是通過測出含氮量來估算蛋白質含量，因此添加三聚氰胺會使食品的蛋白質測試含量偏高，從而使劣質食品通過食品檢驗機構的測試[3-4].而長期或反復大量攝入三聚氰胺可能造成生殖、泌尿系統損害，膀胱、腎部結石等，并可能進一步誘發膀胱癌[5-6].所以開發一種能夠在食品中快速高效檢測三聚氰胺的方法是十分必要的.

目前三聚氰胺痕量的檢測方法主要有紅外光譜法、高效液相色譜法、色譜-質譜聯用法、電化學法、酶聯免疫吸附法、比色法等[7-13].然而上述幾種方法，操作復雜、流程較長、設備昂貴，因此我們需要一種能夠快速有效的方法來檢測三聚氰胺.近年來出現的納米熒光檢測技術具有選擇性好、靈敏度高、操作簡便、經濟實用等優點，已經被廣泛用于痕量檢測、熒光標記等領域[14-16].但是由于納米熒光探針檢測只基于單一的熒光變化，因此會受到儀器以及外部環境的干擾.新型的比率型納米熒光探針能夠基于兩種不同的發射波長的熒光來檢測目標物質，利用比率熒光的自校準作用能夠有效排除外界干擾因素，從而能更加準確的對痕量三聚氰胺進行檢測.

合成了一種聚合物點/金納米簇比率熒光探針，該熒光探針的比率熒光探針由兩部分組成，分別為含有大量氨基功能團的聚乙烯亞胺聚合物點(PEI-PDs)和羧基保護的金納米簇(AuNCs)，制備得到的熒光探針能夠通過比率熒光方法應用于三聚氰胺的痕量檢測，并且對該熒光探針對三聚氰胺檢測的抗干擾性、靈敏性、選擇性等進行了檢測.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

聚乙烯亞胺(PEI，MW 10000)，谷胱甘肽(GSH)購買于上海阿拉丁試劑公司.抗壞血酸(AA)，20種天然氨基酸(Val，Met，Cys，Ile，Pro，Arg，Phe，Gly，Gln，Glu，Thr，Trp，Ser，Ala，Asp，Lys，Leu，Asn，Tyr，His)購買于南京奧多福尼生物科技有限公司，所有的化學藥品均是分析純，且沒有再純化.超純水用于整個實驗過程.

熒光光譜采用LS-55熒光分光光度計測定(英國PE).所有玻璃耗材用電熱鼓風干燥箱烘干(上海一恒科學儀器有限公司).觀察熒光效果用ZF-20D暗箱三用紫外分析儀，紫外波長：254、365、254+365 nm，儀器功率40 w(上海驥輝科學分析儀器有限公司).

1.2 實驗過程

(1)金納米簇的制備

向摩爾濃度為20 mM的氯金酸(HAuCl4·3H2O)溶液中，加入谷胱甘肽(GSH)與氯金酸(摩爾比為2︰1 )在室溫下攪拌孵育15 min，然后60 ℃水浴加熱條件下，繼續攪24 h，得到金納米簇，最后將所得溶液在4 ℃條件下冷藏保存.[17]

(2)PEI點的制備

向超純水中加入PEI，攪拌分散40 min，后加入還原劑AA(PEI:AA=50︰1)繼續攪拌5 min后，將體系溫度升至200 ℃，繼續攪拌3 h，期間每隔18 min加一次水防止溶液全部蒸發.最后得到明亮的PEI點[18].

(3)比率熒光體系的組裝

將制備好的金納米簇和PEI按照質量比1︰0.35的比例加入到緩沖溶液中，使得混合溶液中PEI-PDs質量濃度為15 μg/mL，AuNCs的質量濃度為42.5 μg/mL.最后將混合溶液在室溫下孵育10～20 min,得到PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針.

(4)對三聚氰胺進行檢測

向準備好的待測樣品中加入PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針，孵育兩分鐘后，測試其熒光光譜，通過觀察其熒光強度比值(I615/I440)的變化可以實現對三聚氰胺的比率熒光檢測.

(5)實物檢測樣品的預處理

為了除去樣品牛奶中的蛋白質及脂肪，對牛奶樣品進行預處理.取1 mL牛奶用水稀釋至10 mL，然后加入2 mL 5%的三氯乙酸溶液，用漩渦儀混勻1 min，再超聲處理30 min.之后，將該混合物在10 000 rpm速度下離心10 min.取上清液，再用0.2 mm的超濾膜過濾，濾液在4 ℃下保存備用.

2 結果與討論

2.1 PEI-PDs與AuNCs質量濃度比對PEI-PDs/AuNCs熒光強度的影響

本文合成的PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針，由PEI-PDs和AuNCs兩種熒光探針組成，制備過程簡單、易操作、條件溫和、耗時短，該熒光探針的最強激發波長為310～320 nm，最強發射波長在440～445 nm左右以及610～615 nm左右，具有比率熒光特征.為了了解PEI-PDs與AuNCs質量濃度比對PEI-PDs/AuNCs熒光強度的影響，將不同物質量的PEI-PDs與HEPES 緩沖溶液(pH為7.4)混合，得到PEI-PDs溶液，分別加入AuNCs，使得PEI-PDs與AuNCs的質量比為(0.2︰1、0.25︰1、0.3︰1、0.35︰1、0.4︰1)，攪拌10 min，自組裝得到PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針.圖1為不同質量濃度下的PEI-PDs對比率熒光探針熒光強度的影響.從圖中可以看出當PEI-PDs與AuNCs的質量比為0.35︰1時，兩種熒光強度比值最佳.

Wavelength/nm圖1 PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針熒光強度隨PEI-PDs與AuNCs質量濃度比變化的熒光光譜

2.2 PEI-PDs/AuNCs對三聚氰胺的響應時間

用本文合成的熒光探針對三聚氰胺進行檢測，在PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針的HEPES緩沖溶液(pH為7.4)中加入20 μM三聚氰胺，如圖2所示，隨著時間的增加，PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針熒光強度比值(I615/I440)在0～2 min逐漸增加，最后在孵育2 min后達到穩定，由此可以確定PEI-PDs/AuNCs可以對三聚氰胺進行檢測.

Time/min圖2 PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針熒光強度比值(I615/I440)在加入20 μM三聚氰胺后，隨孵育時間變化的曲線圖

2.3 PEI-PDs/AuNCs對三聚氰胺檢測性能分析

為了解三聚氰胺濃度對PEI-PDs/AuNCs熒光強度的影響，向HEPES緩沖溶液(pH為7.4)中加入PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針(其中PEI-PDs質量濃度為15 μg/mL，AuNCs的質量濃度為42.5 μg/mL)，然后分別加入不同濃度三聚氰胺，孵育2 min后，得到三聚氰胺濃度分別為0、0.1、0.5、1、2、3、5、10、20 μM的待測液體，在室溫條件下進行熒光測試(激發波長為315 nm)，由圖3(a)所示，采用315 nm波長激發，PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針的發射光譜峰位分別在～440 nm和～615 nm，并且在～440 nm處的熒光強度隨著三聚氰胺的濃度上升而增加.以615 nm和440 nm 處熒光強度比值(I615/I440)為縱坐標，三聚氰胺的物質的量濃度(C)為橫坐標建立PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針對三聚氰胺檢測的線性曲線，從圖3(b)可以看出，該曲線具體為I615/I440=0.009 92C+1.141 93,440 nm和615 nm處的熒光強度比值(I615/I440)對于三聚氰胺的物質的量濃度(C)的線性響應在 0～20 μM(R2=0.998 66)之間，檢測限0.23 μM，說明PEI-PDs/AuNCs對三聚氰胺檢測的靈敏性極佳.

Wavelength/nm(a)PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針熒光強度比值(I615/I440)隨三聚氰胺濃度變化的熒光光譜圖

CMe/μm(b)PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針熒光強度比值(I615/I440)隨三聚氰胺濃度變化的關系曲線圖圖3 熒光響應圖

2.4 PEI-PDs/AuNCs對三聚氰胺熒光響應的選擇性和抗干擾分析

此外，還分析了PEI-PDs/AuNCs對其他相關的物質(離子及氨基酸等)的影響，將這些物質采用超純水制備成溶液檢驗PEI-PDs/AuNCs對三聚氰胺的抗干擾性，將20 μM不同的常見離子和天然氨基酸(Na+，K+，Ca2+，Mg2+，Cl-，NO3-，CO3-，纈氨酸Val ，色氨酸Trp，組氨酸His，甘氨酸Gly，苯丙氨酸Phe，天冬酰胺Asn，蛋氨酸Met，精氨酸Arg，脯氨酸Pro，谷氨酸Glu)分別加入到PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針HEPES緩沖溶液中(其中PEIPDs質量濃度為15 μg/mL，AuNCs的質量濃度為42.5 μg/mL，pH為7.4)，孵育2 min，得到不同離子和氨基酸對三聚氰胺選擇性的影響.如圖4所示，不同的離子和天然氨基酸對三聚氰胺熒光響應沒有顯著影響，只有三聚氰胺可以明顯地增強該熒光探針的熒光強度.因此我們可以確定該熒光探針對三聚氰胺有很高的選擇性且抗干擾性極強，將會是檢測三聚氰胺非常有效的一種方法.

圖4 PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針對三聚氰胺熒光響應在常見陰、陽離子和天然氨基酸中的選擇性分析柱形圖

2.5 實物檢測

為了測試該比率熒光探針在實際檢測中的應用表現，我們選取牛奶為樣本，所有的牛奶樣品均來自于當地農場.用制備的PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針測試已經去除蛋白質和脂肪的牛奶中三聚氰胺的含量.取3份相同的牛奶樣品，加入不同含量的三聚氰胺(2、5、10 μM )，標記為1#～3#，之后加入相同濃度的PEI-PDs/AuNCs溶液(其中PEI-PDs質量濃度為15 μg/mL，AuNCs的質量濃度為42.5 μg/mL).孵育2 min后，進行熒光光譜測試.從表1可以看出樣品一中三次檢測的三聚氰胺濃度為1.98、1.89和1.97 μM，回收率為97.3%，相對標準偏差為4.93%.檢測樣品二中三次檢測的三聚氰胺濃度為 5.11、5.07和5.13 μM，回收率為102.1%，相對標準偏差為3.06%.檢測樣品三中三次檢測的三聚氰胺濃度為10.09、10.12和10.16 μM，回收率為101.2%，相對標準偏差為3.51%.結果表明回收率在97%～102.1%之間，相對標準偏差(RSDs) 均低于5%，說明PEI-PDs/AuNCs可以應用在實物檢測中.

表1 采用PEI-PDs/AuNCs比率熒光探針在牛奶中檢測三聚氰胺殘留

3 結 論

綜上所述，合成了一種聚合物點/金納米簇比率熒光探針(PEI-PDs/AuNCs)，可以用于三聚氰胺的痕量檢測，其制備過程簡單、易操作、條件溫和、耗時短，并且該比率型納米熒光探針能夠基于兩種不同的發射波長的熒光來檢測目標物質，利用比率熒光的自校準作用能夠有效排除外界干擾因素，因此該熒光探針的靈敏度高，檢測結果準確、選擇性好、抗干擾性高，同時該比率熒光探針成功地檢測出牛奶中三聚氰胺的含量，在實物檢測中獲得了很好地效果，說明該熒光探針在檢測三聚氰胺的領域內具有很好的前景.