嗜熱革節孢內切葡聚糖酶EGⅠ中精氨酸Arg7的功能分析

于偉帥 李多川

摘要：本研究將嗜熱革節孢GH45家族內切葡聚糖酶EGⅠ中的底物結合位點精氨酸Arg7進行飽和突變，測定其性質、動力學參數的變化，以期分析精氨酸Arg7 的功能。結果表明，與原酶相比，突變酶R7A的Km有所下降，R7P的kcat顯著性提高，但突變酶的kcat/Km均顯著性降低。原酶的最適反應溫度為50℃，突變酶R7C、R7P和R7V的則為40℃，其余突變酶的均為50℃。原酶于70℃下處理2 h具有61%的活性，相同處理條件下，突變酶R7F、R7H仍具有70%以上的活性，說明其熱穩定性明顯提高，R7A僅有20%的活性，剩余突變酶均有40%左右的活性。原酶的反應最適pH值為5.0，而突變酶R7C的為6.0，剩余突變酶的均為5.0。本試驗探究了精氨酸Arg7飽和突變后嗜熱革節孢GH45家族內切葡聚糖酶的性質變化，可為GH45家族進一步的分子改造和功能研究提供參考。

關鍵詞：嗜熱革節孢;內切葡聚糖酶;飽和突變;酶學性質;熱穩定性

中圖分類號：Q783 ?文獻標識號：A ?文章編號：1001-4942（2020）02-0019-08

Abstract Scytalidium thermophilium is a thermophilic fungus whose thermal stability and catalytic activity are the most important properties of industrial enzymes. In this study， the substrate binding site Arg7 in the endoglucanase EGⅠ of GH45 family was saturated mutated， and the changes of properties and kinetic parameters were analyzed. The results showed that only the Km of the mutant enzyme R7A decreased， and the kcat of the mutant enzyme R7P significantly increased， but the kcat/Km of the mutant enzyme significantly decreased compared with the wild enzyme. The optimum reaction temperature of WT was 50℃， while that of R7C， R7P and R7V was 40℃， and that of the residual mutant enzymes was 50℃. The wild enzyme still had 61% activity after treatment at 70℃ for 2 h， and the thermal stability of the mutant enzymes R7F and R7H improved significantly， and more than 70% of the activity was observed after treatment; the activity of the mutant enzyme R7A was only 20% after treated at 70℃ for 2 h， and the other mutant enzymes had about 40% of activity. The optimum pH of WT was 5.0， while the optimum pH of the mutant R7C was 6.0， and the optimum pH of the other mutant enzyme was 5.0. The above results could provide references for further molecular transformation and function study of the GH45 family.

Keywords Scytalidium thermophilium;Endoglucanase; Saturation mutation; Enzymatic properties; Thermal stability

纖維素是植物細胞壁的主要成分，是自然界中非常豐富的可再生資源。纖維素酶具有降解纖維素的能力，可將其水解成單糖，在纖維素再利用過程中起著重要作用。研究發現，纖維素的水解需要三種類型的纖維素酶協同作用：首先是內切葡聚糖酶 （endo-β-1，4-glucanases， EC 3.2.1.4）與纖維素隨機結合，水解 β-1，4-糖苷鍵生成短鏈纖維素，隨后外切葡聚糖苷酶 （exo-1，4-β-glucanase， EC 3.2.1.91）作用于纖維寡糖末端，切下一個纖維二糖分子，最后由β-葡萄糖苷酶 （β-1，4-glucosidases， EC 3.2.1.21） 將纖維二糖分子水解為單糖[1，2]。其中，內切葡聚糖酶廣泛存在于微生物對纖維素的水解過程中[3-5]，被認為是纖維素再利用過程中的重要工業用酶，是開發最為廣泛的纖維素酶產物。

根據蛋白質序列相似性和催化結構域的結構，CAZy數據庫中 （http：//www.cazy.org） 內切葡聚糖酶分屬于15個糖苷水解酶（GH）家族，包括GH5、GH6、GH7、GH8、GH9、GH10、GH12、GH26、GH44、GH45、GH48、GH51，GH74、GH124和GH148。與大多數糖苷水解酶家族中的酶不同，GH45家族成員僅為內切葡聚糖酶，該酶具有低分子量和高活性[6，7]。此外，Hirvonen等發現GH45內切葡聚糖酶對無定形纖維素具有更高的活性，并且在工業應用中具有很大潛力[8]，所以該酶的功能和結構研究對學術和工業領域都非常重要。GH45家族酶的主要結構特征是由六鏈β-barrel組成的結構域，并且具有跨越蛋白質表面的開放性底物結合槽[8]。目前，GH45家族酶的結構可細分為兩組：組Ⅰ在 β-barrel 和由幾個長環組成的區域之間形成底物結合槽，而組Ⅱ中酶的底物結合槽主要由 β-barrel 形成[8，9]。

嗜熱革節孢（Scytalidium thermophilium） 是一種嗜熱真菌，其熱穩定性和催化活性是工業用酶的最重要屬性。目前，除了對嗜熱真菌本身進行改造以提高其生產纖維素酶的能力外，酶的工程性改造也一直是研究熱點。本研究擬克隆嗜熱革節孢GH45家族內切葡聚糖酶基因egⅠ，并將底物結合位點Arg7進行飽和突變，測定酶的性質、熱穩定性、動力學參數的變化，以探究Arg7的功能和飽和突變對EGⅠ的影響，旨在為GH45家族進一步的分子改造提供參考。

1 材料與方法

1.1 菌株和質粒

嗜熱革節孢 （Scytalidium thermophilium） 菌株，由山東農業大學分子真菌學課題組篩選得到;大腸桿菌 （Escherichia coli） 菌株、質粒pPIC9K、畢赤酵母GS115，由山東農業大學微生物重點實驗室保存。

1.2 主要試劑

Trans2K DNA Marker、限制性核酸內切酶和其它工具酶，以及PCR試劑盒、點突變試劑盒均購自北京全式金生物技術有限公司;RNA提取試劑盒、SDS-PAGE凝膠制備試劑盒購自北京康為世紀生物科技有限公司;質粒提取試劑盒購自天根生化科技有限公司;膠回收試劑盒購自Omega公司;必克隆新一代試劑盒購自南京愛必夢生物材料有限公司;二喹啉甲酸 （bicin-choninic acid， BCA） 蛋白定量試劑盒購自杭州弗德生物科技有限公司;LB培養基、YPD培養基、BMGY和BMMY培養基等，自備。

1.3 egⅠ基因的克隆

將嗜熱革節孢接種到纖維素誘導培養基上，50℃培養3 d，刮取菌絲提取總RNA，反轉錄得到cDNA。根據嗜熱革節孢GH45家族內切葡聚糖egⅠ的基因序列 （GenBank： HG313887.1） 設計引物，并在上下游引物中分別插入EcoRⅠ 和NotⅠ酶切位點（下劃線標記）。在下游引物加入6個組氨酸 （His） 標簽（波浪線標記），上下游引物序列：EGⅠ-F：5′-GCTTACGTAGAATTCGCTGATGGCAAGTCCACCCG-3′;EGⅠ-R：5′-TTAATTCGCGGCCGCATGATGATGATGATGATGCAGGCACTGATGGTACCA-3′。PCR反應體系：cDNA 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O補足體積至50 μL。反應程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 30 s，30個循環;72℃ 5 min。將PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳檢測，回收片段并保存備用。

1.4 重組質粒和突變質粒的構建

用EcoRⅠ和NotⅠ 將pPIC9K 質粒進行雙酶切，根據必克隆試劑盒說明書將其和egⅠ 目的片段連接，獲得重組質粒pPIC9K/egⅠ，轉化大腸桿菌Trans -T1，挑單斑進行PCR驗證，篩選陽性克隆并測序鑒定。

根據點突變試劑盒的要求，設計突變引物（表1）。定點突變PCR反應體系：pPIC9K/egⅠ 100 ng，5×TransStart FastPfu Fly Buffer 10 μL，10 μmol/L上下游引物各2 μL，2.5 mmol/L dNTPs 5 μL，TransStart FastPfu Fly DNA 1 μL，ddH2O補足體積至50 μL。反應程序：94℃ 2 min;94℃ 20 s，55℃ 20 s，72℃ 3 min，25個循環;72℃ 10 min，4℃保存。取10 μL PCR產物進行瓊脂糖凝膠電泳， 剩余產物加入1 μL DMT酶，混勻，37℃處理1 h后轉化大腸桿菌Trans -T1，挑單斑進行PCR驗證，反應體系與反應程序同上。PCR反應陽性者測序，測序正確后提取質粒。

1.5 重組質粒和突變質粒轉化、轉化子篩選和表型鑒定

重組質粒和突變質粒經SalⅠ線性化酶切，酶切產物分別通過電擊法轉入畢赤酵母GS115，轉化后在MD平板上28℃培養，待出現單斑后用G418 （1、2、3、4 mg/mL） 進行篩選、檢測，獲得拷貝數較高的菌株，利用通用引物3′AOX1、5′AOX1 進行PCR擴增及測序驗證。

1.6 酵母工程菌的誘導表達與蛋白的分離純化

將測序正確的兩類酵母工程菌株分別接種于BMGY培養基，28℃、200 r/min培養24 h，離心并將菌體轉入BMMY培養基中，28℃、200 r/min培養7 d，每隔12 h甲醇誘導一次，8 000 r/min離心獲取上清液。上清液中加入硫酸銨至90%飽和并于4℃下靜置過夜、離心，適量PBSA緩沖液透析，后經HisTrap HP柱純化。純化后酶液一部分進行SDS-PAGE檢測，剩余部分進行酶性質測定。

1.7 酶性質測定

1.7.1 酶活力 采用BCA法進行蛋白濃度測定[10]，DNS法[11]測定酶活性。酶促反應體系：0.1 mg/mL純化酶液100 μL，10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL，0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL，混勻后50℃孵育30 min，后加入300 μL DNS溶液沸水煮10 min，立即冰浴，于540 nm波長處測得吸光值，測定酶活力，計算酶的比活力。

1.7.2 酶動力學參數 配制濃度分別為4、6、8、10、12 mg/mL的CMC-Na溶液。酶促反應體系同1.7.1。根據 Lineweaver-Burk作圖法，計算米氏常數 （Km）、催化常數 （kcat）及kcat/Km。

1.7.3 酶最適反應溫度 取0.1 mg/mL純化酶液100 μL、0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL混勻，分別置于40、50、60、70、80℃下孵育30 min，測定原酶WT和突變酶在不同溫度下的酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對酶活力。

1.7.4 酶反應最適pH值 將0.1 mg/mL純化酶液100 μL、10 mg/mL CMC-Na溶液100 μL混勻后分別加入100 μL pH值分別為3.0、4.0、5.0、6.0、7.0、8.0、9.0的0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液，50℃下孵育30 min，測定酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對酶活力。

1.7.5 酶熱穩定性 將0.1 mg/mL純化酶液100 μL 分別在40、50、60、70、80℃下處理2 h，加入0.2 mol/L HAc-NaAC緩沖液（pH=5.0） 100 μL、10 mg/mL的CMC-Na溶液100 μL，混勻后于50℃孵育30 min，測定酶活力，以最高酶活力作為100%，其它酶活力換算為相對酶活力。

1.8 原酶和突變酶三維結構模擬及分析

將WT和各突變酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL網站 （http：//swissmodel.expasy.org/） 進行三維建模，用PYMOL軟件進行分析。

2 結果與分析

2.1 egⅠ基因的克隆

嗜熱革節孢經總RNA提取、反轉錄、PCR擴增后，得到約870 bp的基因片段，如圖1所示，與理論值大小相符。序列測序結果表明，編碼EG Ⅰ成熟肽鏈的序列由870個核苷酸組成，擴增得到的序列與egⅠ基因的相似度為99%。

2.2 酶的誘導表達及分離純化

將構建好的酵母工程菌株于BMMY中培養，后將酶蛋白分離純化，進行SDS-PAGE檢測。如圖2所示，試驗獲得了較高純度的酶液，蛋白分子量為40 kD，較理論值 （30 kD） 稍大，推測原因是酶蛋白在異源表達過程中進行了糖基化修飾;將WT序列提交在線糖基化位點預測服務器（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetNGlyc/）進行檢測，顯示存在糖基化修飾。

2.3 酶性質的測定及分析

2.3.1 酶的比活力以及動力學參數分析 由表2可以看出，與WT相比，突變酶的活性均有所降低，其中R7A、R7C、R7D、R7H、R7M的比活力分別為WT的79%、57%、68%、77%、56%，其它突變酶的比活力均為WT的50%以下，而R7P、R7W僅為WT的22%、24%。Km可近似地表示酶與底物親和力的大小，Km越小，表示親和力越大。

與原酶相比，除R7A外各突變酶Km均有顯著性增大，說明只有突變酶R7A對底物的親和力有所提高;kcat可表示酶催化底物的能力，突變酶R7P的kcat與原酶相比有顯著性提高，表明突變酶R7P提高了產物的釋放效率;kcat/Km可用來衡量酶的催化效率，雖然個別突變酶的Km、kcat有所增大，但與原酶相比，突變酶的kcat/Km都顯著性降低，說明突變降低了酶的催化效率，從而導致酶活性降低。

2.3.2 突變對酶最適反應溫度的影響 由表3可以看出，WT 的最適反應溫度為50℃，突變酶R7C、R7P和R7V 的則為40℃，其它突變酶的均為50℃。說明在一定程度上R7的突變會改變酶的最適溫度。

2.3.3 突變對酶反應最適pH值的影響 由表4可知，不同酶促反應中，WT 的最適pH 值為5.0，而突變酶R7C的為6.0，其余突變酶的最適pH值均為5.0。說明R7C的突變改變了酶促反應的最適pH值，推測可能是由于突變導致活性中心的電荷分布發生變化，影響了反應的最適pH值。

2.3.4 突變對酶熱穩定性的影響 由表5可以看出，WT具有較高的熱穩定性，于70℃下處理2 h仍具有61.73%的活性，突變酶R7F、R7H 的熱穩定性明顯高于WT，相同處理條件下具有70%以上的活性，而R7A僅剩20.25%的活性，熱穩定性明顯下降，其它突變酶仍具有40%左右的活性。

2.4 三維建模及對比

根據Davies 等[12]1996年建立的構建WT三維模型 （PDB：1HD5）的方法，分別將剩余19種突變酶的氨基酸序列提交到SWISS-MODEL服務器獲得三維結構模型。將WT、R7A、R7C、R7D、R7H、R7M、R7P和R7W（圖3）進行比較分析可知，R7的突變使酶結構發生變化，導致酶與底物的結合發生變化，從而影響了酶的催化效率。

3 討論與結論

Doucet等[13]利用點飽和突變技術對大腸桿菌的β-內酰胺酶Tyr105進行點飽和突變， 表明Tyr105能提高酶的底物親和能力;Gabor等[14]對青霉素酰化酶進行點飽和突變，獲得活性提高的突變子;Miyazaki等[15]對枯草芽孢桿菌蛋白酶進行點飽和突變，獲得熱穩定性明顯提高的突變子。因此，蛋白質工程中點飽和突變技術較定點突變技術更有優勢，可更大概率獲得進化子。本研究中，對內切葡聚糖酶的Arg7進行飽和突變，能夠更深入探究Arg7突變對酶性質和結構的影響。

研究表明，GH45家族的內切葡聚糖酶催化機理是轉化底物的異頭構型[12]。通過對特異腐質霉纖維二糖復合物的晶體結構進行識別，得出Asp121、Asp10分別作為催化的酸和堿，并且這兩種殘基是第45家族酶的所有序列中唯一完全保守的酸性殘基[8，12]。Davies等[12]認為Asp121是催化質子供體，位于疏水為主的環境中，一側是Ala73和Ala74的疏水側鏈，同時它還是與Thr6的羥基相互作用的氫鍵的組成部分。根據R7A的三維結構模型分析，Arg7突變為丙氨酸后有可能會增加催化中心周圍環境的疏水性，使活性中心與底物結合更緊密。這種酶的底物結合槽有所不同，它沒有與糖作用的芳香族殘基形成的通道[16]，在其底物結合槽上僅發現Trp18一個芳香族殘基，而且底物結合槽內有可能存在氫鍵[17]。芳香族氨基酸能夠參與疏水堆積表面的形成，使纖維長鏈更易進入催化中心[18]，而纖維素酶與纖維素的結合主要是依靠氫鍵和疏水作用[19]。本試驗中，將Arg7 突變為芳香族氨基酸后并沒有達到預期效果，活性沒有提高，反而降低了酶與底物的結合能力和產物的釋放效率，推測原因可能是氨基酸側鏈發生了變化，從而對催化活性產生影響。

熱穩定性高的纖維素酶在拓寬工業用酶的用途中非常重要。De Souza 等[20]發現熱穩定性提高可以歸因于更多數量的螺旋和鹽橋，它們在催化核心中顯示出正電荷，從而穩定三級結構。蛋白質的熱穩定性主要是疏水作用、二硫鍵、鹽橋和氫鍵幾種力的同時作用，這些相互作用導致多肽鏈的靈活性降低[21，22]。GH45家族的內切葡聚糖酶中有七對二硫鍵，研究表明二硫鍵在纖維素酶的熱穩定性中起著重要作用[23，24]。本研究發現，原酶具有較高的熱穩定性，突變酶R7F的熱穩定性提高的原因可能是突變R7F的芳香族側鏈與周圍的氨基酸發生疏水作用。WT 的最適反應溫度和最適pH值分別為50℃和5.0。這與報道[25]的GH45家族的其余纖維素酶相似。

本研究克隆并表達了嗜熱革節孢GH45家族內切葡聚糖酶基因egⅠ，同時對Arg7進行飽和突變并進行了酶性質測定。發現突變酶的活性較原酶均有所降低，只有突變酶R7A與底物的結合力有所提高;突變酶R7P提高了產物的釋放效率;突變酶R7C、R7P和R7V的最適反應溫度，R7C的最適反應pH值發生改變;在熱穩定性方面，只有突變酶R7F、R7H的明顯提高。本研究更深入地探究了Arg7突變對酶性質和結構的影響，可為下一步的纖維素酶研究提供參考。

參 考 文 獻：

[1] Bhat M K， Bhat S. Cellulose degrading enzymes and their potential industrial applications[J]. Biotechnology Advances， 1997， 15（3/4）：583-620.

[2] Gaur R，Tiwari S. Isolation， production， purification and characterization of an organic-solvent-thermostable alkalophilic cellulase from Bacillus vallismortis RG-07[J]. BMC Biotechnology， 2015， 15：19.

[3] Béguin P， Millet J， Chauvaux S， et al. Bacterial cellulases[J]. Biochem.Soc.Trans.，1992， 20：42-46.

[4] Ohmiya Y， Takeda T， Nakamura S， et al. Purification and properties of a wall-bound endo-1，4-β-glucanase from suspension-cultured poplar cells [J]. Plant and Cell Physiology， 1995， 36（4）：607-614.

[5] Inoue T，Murashima K， Azuma J I， et al. Cellulose and xylan utilisation in the lower termite Reticulitermes speratus[J]. Journal of Insect Physiology， 1997， 43（3）：235-242.

[6] Gao J， Huang J W， Li Q， et al. Characterization and crystal structure of a thermostable glycoside hydrolase family 45 1，4-β-endoglucanase from Thielavia terrestris[J]. Enzyme and Microbial Technology， 2017， 99：32-37.

[7] Couturier M，Feliu J， Haon M， et al. A thermostable GH45 endoglucanase from yeast： impact of its atypical multimodularity on activity[J]. Microbial Cell Factories， 2011， 10：103.

[8] Hirvonen M， Papageorgiou A C. Crystal structure of a family 45 endoglucanase from Melanocarpus albomyces： mechanistic implications based on the free and cellobiose-bound forms[J]. Journal of Molecular Biology， 2003， 329（3）：403-410.

[9] Nakamura A， Ishida T，Kusaka K， et al. "Newtons cradle" proton relay with amide-imidic acid tautomerization in inverting cellulase visualized by neutron crystallography[J]. Science Advances， 2015， 1：e1500263.

[10] 李海玲， 彭書明， 李凜， 等. 4種常用蛋白濃度測定方法的比較[J]. 中國生化藥物雜志， 2008（4）：277-278，282.

[11] Ahmed I N， Chang R， Tsai W B. Poly（acrylic acid）nanogel as a substrate for cellulase immobilization for hydrolysis of cellulose[J]. Colloids and Surfaces B： Biointerfaces， 2017， 152：339-343.