血清同型半胱氨酸、葉酸、維生素B12水平及MTHFR基因C677T多態(tài)性與妊娠期糖尿病的相關(guān)性研究

倪菲菲 鄭加永 徐曉敏

[摘要] 目的 探討和分析血清同型半胱氨酸（Hcy）、葉酸（FA）、維生素（Vit）B12水平及亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）基因C677T多態(tài)性與妊娠期糖尿病（GDM）的相關(guān)性。 方法 選擇2016年5月～2017年10月在溫州市人民醫(yī)院產(chǎn)前門診就診的中孕期確診的97例GDM孕婦為觀察組，同期產(chǎn)檢正常的102例孕婦作為對(duì)照組，采用熒光定量PCR技術(shù)檢測(cè)MTHFR基因C677T多態(tài)性，并采用循環(huán)酶法檢測(cè)血清Hcy水平，化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè)血清FA、VitB12水平，比較兩組上述指標(biāo)的差異。 結(jié)果 GDM組MTHFR C677T等位基因T頻率顯著高于對(duì)照組。觀察組血清Hcy水平高于對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。觀察組血清FA、VitB12水平均低于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。采用多變量Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)Hcy是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。 結(jié)論 Hcy是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，暫未發(fā)現(xiàn)MTHFR C667T基因多態(tài)性、VitB12和FA是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。孕期對(duì)GDM患者監(jiān)測(cè)血Hcy具有重要意義，可指導(dǎo)其補(bǔ)充VitB12和FA降低血Hcy水平。

[關(guān)鍵詞] 妊娠期糖尿病;亞甲基四氫葉酸還原酶（MTHFR）;同型半胱氨酸;葉酸;維生素B12

[中圖分類號(hào)] R714.256 ? ? ? ? ?[文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼] B ? ? ? ? ?[文章編號(hào)] 1673-9701（2020）12-0068-04

[Abstract] Objective To investigate and analyze the relevance of serum homocysteine （Hcy）， folic acid （FA）， vitamin（Vit） B12 levels and methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） gene C677T polymorphism and gestational diabetes mellitus（GDM）. Methods 97 cases of GDM pregnant women diagnosed in the second trimester of pregnancy in the prenatal clinic of Wenzhou People's Hospital from May 2016 to October 2017 were selected as observation group. 102 pregnant women with normal checkups were used as control group. The C677T polymorphism of MTHFR gene was detected by real-time PCR. And the level of serum Hcy was detected by circulating enzyme method. The levels of serum FA and VitB12 were detected by chemiluminescence immunoassay. The differences of the above indexes were compared. Results The frequency of MTHFR C677T allele T in the GDM group was significantly higher than that in the control group. The serum Hcy level of the observation group was higher than that of the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. The serum levels of FA and VitB12 in the observation group were lower than those in the control group， and the difference was statistically significant（P<0.05）. Multivariate Logistic regression analysis found that Hcy was an independent risk factor for GDM. Conclusion Hcy is an independent risk factor for the pathogenesis of GDM. The MTHFR C667T gene polymorphism， VitB12 and FA are not considered as independent risk factors for GDM. It is important to monitor blood Hcy in patients with GDM during pregnancy， which can guide them to supplement VitB12 and FA to reduce blood Hcy levels.

[Key words] Gestational diabetes mellitus; Methylenetetrahydrofolate reductase （MTHFR）; Homocysteine; Folic acid; Vitamin B12

妊娠期糖尿病（Gestational diabetes mellitus，GDM）是指妊娠前糖代謝正常或有潛在糖耐量減退，妊娠期才出現(xiàn)或發(fā)現(xiàn)的糖尿病[1]，是一種常見的妊娠期疾病，隨著2013年WHO制定出GDM的診斷新標(biāo)準(zhǔn)，其發(fā)生率也呈逐年升高的趨勢(shì)[2]，國(guó)外報(bào)道為1%～14%，我國(guó)發(fā)生率為17.5%[3]。GDM的病理生理過程與2型糖尿病相似，胰島素抵抗（IR）是其主要的發(fā)病機(jī)制[4]，IR可引起血同型半胱氨酸（Homocysteine，Hcy）增高，高Hcy血癥可加重糖尿病血管病變。維生素（Vitamin，Vit）B12和葉酸（Folic acid，F(xiàn)A）缺乏是2型糖尿病尿病患者Hcy增高的重要因素[5]。而亞甲基四氫葉酸還原酶（Methylenetetrahydrofolate reductase，MTHFR）是調(diào)控體內(nèi)葉酸代謝和Hcy甲基化水平的關(guān)鍵酶，MTHFR基因突變能提高Hcy水平。本文通過研究妊娠期糖尿病患者M(jìn)THFR基因多態(tài)性與血清FA、VitB12及Hcy水平的關(guān)系，探討MTHFR基因是否參與GDM的發(fā)生、發(fā)展，為GDM的病因探索提供依據(jù)，從而為GDM的預(yù)防和治療提供新的途徑，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇2016年5月～2017年10月在我院門診產(chǎn)檢的中孕期孕婦。妊娠期糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)參照2014年中華婦產(chǎn)科雜志的妊娠合并糖尿病診治指南[6]：75 g OGTT服糖前及服糖后1 h、2 h，3項(xiàng)血糖值應(yīng)分別低于5.1 mmol/L、10.0 mmol/L和8.5 mmol/L。任何一項(xiàng)血糖值達(dá)到或超過上述標(biāo)準(zhǔn)即診斷為GDM。選擇同期OGTT結(jié)果正常的孕婦作為對(duì)照組。排除標(biāo)準(zhǔn)：孕前糖尿病、肝病、腎病、高血壓、冠心病、自身免疫性疾病、甲狀腺疾病、多囊卵巢綜合征及近期服用維生素史。所有受試者簽署知情同意書。GDM組與對(duì)照組受試者一般資料見表1，兩組間年齡、孕產(chǎn)次無顯著差異（P>0.05），具有可比性。

1.2 方法

1.2.1 MTHFR基因多態(tài)性分析 ?采用熒光定量PCR技術(shù)分析MTHFR C667T基因位點(diǎn)突變：10 μL：1 μL DNA模板（20 ng/μL）5 μL Taqman Universal Master Mix，0.5 μL Taqman-MGB探針，3.5 μL去離子水。反應(yīng)條件：95℃預(yù)變性10 min，92℃變性15 s，60℃延伸1 min，20個(gè)循環(huán);89℃變性15 s，60℃延伸90 s，30個(gè)循環(huán)。反應(yīng)完成后在ABI7500型熒光定量PCR儀上讀取樣品孔中的終點(diǎn)熒光，利用分析軟件確定各個(gè)樣本的基因分型結(jié)果。相關(guān)儀器與試劑均購(gòu)自美國(guó)ABI公司。

1.2.2 Hcy濃度測(cè)定 ?采用循環(huán)酶法檢測(cè)，抽取空腹靜脈血液3 mL，高速離心取血清;全自動(dòng)生化分析儀雙試劑循環(huán)酶法檢測(cè)Hcy水平。

1.2.3 FA及VitB12水平測(cè)定 ?采用化學(xué)發(fā)光免疫法檢測(cè);使用配套試劑盒（美國(guó)雅培I2000），嚴(yán)格按說明書操作。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

應(yīng)用SPSS21.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件進(jìn)行分析，正態(tài)性檢驗(yàn)采用單樣本K-S檢驗(yàn)。正態(tài)分布以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x±s）表示，非正態(tài)分布以中位數(shù)及百分位數(shù)[M（P25～P75）]表示。正態(tài)分布資料采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)。非正態(tài)分布且方差不齊資料采用多個(gè)獨(dú)立樣本比較的秩和檢驗(yàn)（Mann-Whitney U）。計(jì)數(shù)資料以[n（%）]表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。多變量統(tǒng)計(jì)分析采用Logistic多元回歸分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組MTHFR C677T基因型及等位基因頻率分布

根據(jù)兩組受試者M(jìn)THFR C677T基因型分布可知，GDM組與對(duì)照組的MTHFR C677T基因分布不同（P<0.05），GDM組T等位基因頻率顯著高于對(duì)照組（P<0.05）。見表2。

2.2 兩組血漿VitB12、Hcy、FA水平比較

GDM組血漿Hcy水平顯著高于對(duì)照組（P<0.05），而VitB12與FA水平低于對(duì)照組（P<0.05）。見表3。

2.3 GDM發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素分析

采用多變量Logistic回歸分析與GDM發(fā)病相關(guān)的危險(xiǎn)因素，包括：血漿Hcy、VitB12、FA和MTHFR C677T基因型。在排除其他因素影響后，發(fā)現(xiàn)血Hcy是GDM發(fā)生的獨(dú)立危險(xiǎn)因素（OR=1.818，95%CI：1.472～2.247，P<0.05），暫未發(fā)現(xiàn)MTHFR C677T基因、FA和VitB12是GDM的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。見表4。

3 討論

GDM對(duì)孕婦的影響主要有：易并發(fā)妊娠期高血壓疾病、羊水過多、巨大兒、增加難產(chǎn)、產(chǎn)道損傷及剖宮產(chǎn)術(shù)的機(jī)率;對(duì)胎兒及新生兒的影響主要有：胎兒生長(zhǎng)受限、死胎、胎兒畸形、新生兒低血糖以及新生兒呼吸窘迫綜合征等;GDM孕婦分娩的兒童遠(yuǎn)期發(fā)生肥胖、高血壓及T2DM的風(fēng)險(xiǎn)也明顯增加。GDM是環(huán)境因素與遺傳因素共同作用導(dǎo)致的代謝性疾病，病因至今尚未完全明確。隨著GDM的發(fā)生率在世界范圍內(nèi)日益升高，如何預(yù)防GDM的發(fā)生，降低孕產(chǎn)婦并發(fā)癥和圍生兒患病率已引起廣泛的重視。

Hcy是一種含硫氨基酸，是蛋氨酸代謝途徑中的中間產(chǎn)物，在FA和VitB12的輔助下可重新合成蛋氨酸。目前關(guān)于妊娠期糖尿病與Hcy的關(guān)系仍存在爭(zhēng)議，Mascarenhas M等[7]研究發(fā)現(xiàn)妊娠期糖尿病患者孕早期Hcy水平與OGTT正常孕婦無明顯差異。本研究測(cè)定孕中期的Hcy水平，發(fā)現(xiàn)GDM組的Hcy水平明顯高于對(duì)照組，VitB12和FA水平低于對(duì)照組，表明GDM孕婦存在Hcy代謝問題以及VitB12、FA的缺乏，與楊梅[8]的研究結(jié)果一致，這可能與GDM發(fā)生相關(guān)，華肖杭[9]報(bào)道GDM患者孕晚期出現(xiàn)高Hcy血癥，可能與糖尿病胰島素抵抗和患者VitB12和FA水平降低相關(guān)，GDM患者宜增加FA和VitB12的攝入，降低Hcy水平，減輕其對(duì) GDM孕婦大血管和微血管的損害以及對(duì)胎兒的不良影響。本研究采用多元回歸分析發(fā)現(xiàn)Hcy是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，而并未發(fā)現(xiàn)VitB12和FA是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，但是VitB12和FA可以通過葉酸代謝通路影響血Hcy水平[10]。Huang Y等[11]動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)妊娠期及哺乳期給予母鼠高葉酸飲食可顯著降低仔鼠的糖耐量受損及胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。Yajnik CS等[12]發(fā)現(xiàn)，缺乏VitB12的孕婦補(bǔ)充FA，可增加子代發(fā)生胰島素抵抗的風(fēng)險(xiǎn)。個(gè)體化補(bǔ)充可有效降低血Hcy水平[13]。然而補(bǔ)充FA和VitB12對(duì)GDM影響的作用機(jī)制，還需要進(jìn)一步研究證實(shí)。

葉酸參與一碳單位的轉(zhuǎn)移及利用，是重要的甲基供體，而VitB12是DNA甲基化過程中的重要輔酶，兩者對(duì)蛋白質(zhì)、核酸的合成、各種氨基酸的代謝以及胚胎的發(fā)育均具有重要作用。而MTHFR則是葉酸代謝通路中的關(guān)鍵酶，將5，10-亞甲基四氫葉酸轉(zhuǎn)化為具有生物學(xué)活性的5-甲基四氫葉酸，然后進(jìn)一步進(jìn)入甲基傳遞通路，為Hcy提供甲基且降低血漿中的Hcy水平。梅慶步等[14]研究發(fā)現(xiàn)MTHFR基因多態(tài)性與2型糖尿病的相關(guān)性。Benrahma H等[15]研究摩洛哥人群中患2型糖尿病的MTHFR基因易感性。MHTFR基因多態(tài)性與糖尿病的關(guān)系研究主要集中于2型糖尿病，與GDM關(guān)系的研究較少。目前在MTHFR基因上發(fā)現(xiàn)有上百個(gè)單核苷酸多態(tài)性[16]。其中C677T與人類疾病的關(guān)系更密切[17]，即MTHFR基因上的677位點(diǎn)C堿基（胞嘧啶）被T堿基（胸腺嘧啶）取代，引起編碼的丙氨酸突變?yōu)槔i氨酸。MTHFR基因經(jīng)C677T方式突變后，可產(chǎn)生三種基因型，即野生型（CC型）、雜合子型（CT型）、純合子型（TT型）。MTHFR基因突變對(duì)Hcy代謝的影響導(dǎo)致血Hcy水平升高的因素有飲食和遺傳兩方面，飲食因素主要是由于膳食中FA和VitB12的缺乏，而遺傳因素與MTHFR基因突變導(dǎo)致酶活性降低有關(guān)[18，19]。研究表明MTHFR CT型基因使其酶活性降至CC型的75%左右，而TT基因型使其活性下降更顯著，可至50%左右或更低[20，21]。MTHFR活性降低，使其在高半胱氨酸向蛋氨酸轉(zhuǎn)化過程中的催化作用降低，Hcy在體內(nèi)蓄積，血漿中Hcy水平升高[22]。程立子等[23]發(fā)現(xiàn)MTHFR C667T基因可能是GDM的遺傳危險(xiǎn)因素，本研究發(fā)現(xiàn)GDM組中MTHFR C677T基因突變高于對(duì)照組，但通過多變量Logistic回歸分析發(fā)現(xiàn)MTHFR 基因多態(tài)性不是GDM的危險(xiǎn)因素，研究結(jié)果與預(yù)想結(jié)果不一致的原因可能是：（1）Hcy受多種因素影響，MTHFR C667T基因突變可能對(duì)Hcy水平影響較小;（2）本研究對(duì)象為孕中期患者，不同孕期患者的Hcy水平可能存在差異，且MTHFR通過腎臟代謝，不同孕期的患者腎小球?yàn)V過率不同，可能使結(jié)果產(chǎn)生偏差;（3）本研究樣本量少，有待擴(kuò)大樣本量進(jìn)一步明確。

綜上所述，Hcy是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，暫未發(fā)現(xiàn)MTHFR C667T基因多態(tài)性、VitB12和FA是GDM發(fā)病的獨(dú)立危險(xiǎn)因素。孕期對(duì)GDM患者監(jiān)測(cè)血Hcy具有重要意義，可指導(dǎo)其補(bǔ)充VitB12和FA降低血Hcy水平。

[參考文獻(xiàn)]

[1] 豐有吉，沈鏗. 婦產(chǎn)科學(xué)[M]. 第2版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：140-143.

[2] 王爽，楊慧霞. 妊娠期糖尿病發(fā)病的危險(xiǎn)因素分析[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49：321-324.

[3] 關(guān)懷，尚麗新. 妊娠期糖尿病流行現(xiàn)狀[J]. 中國(guó)實(shí)用婦科與產(chǎn)科雜志，2015，（1）：91-94.

[4] Catalano，PM. Trying to understand gestational diabetes[J].Diabetic Medicine，2014，31（3）：273-281.

[5] 張巧云，龍憲連，歐紅玲，等. 2型糖尿病中同型半胱氨酸、VitB12、葉酸檢測(cè)的意義[J].中國(guó)實(shí)驗(yàn)診斷學(xué)，2012， 16（3）：497.

[6] 中華醫(yī)學(xué)會(huì)婦產(chǎn)科學(xué)分會(huì)產(chǎn)科學(xué)組. 妊娠合并糖尿病診治指南（2014）[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2014，49（8）：561-569.

[7] Mascarenhas M，Habeebullah S，Sridhar MG. Revisiting the role of first trimester homocysteine as an index of maternal and fetal outcome[J]. Pregnancy，2014，2014：123024.

[8] 楊梅. 血漿同型半胱氨酸、瘦素水平及相關(guān)基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病的關(guān)聯(lián)性研究[D].武漢：華中科技大學(xué)，2016.

[9] 華肖杭. 血清同型半胱氨酸、VitB12、葉酸與妊娠期糖尿病的臨診研究[J]. 浙江中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2013，37（11）：1322-1323.

[10] Fotiou P，Raptis AE，Apergis G，et al. Vitamin status as a determinant of serum homocysteine concentration in type 2 diabetic retinopathy[J]. Journal of Diabetes Research，2015，2014（16）：807209.

[11] Huang Y，He Y，Sun X，et a1. Maternal high folic Acidsupplement promotes glucose intolerance and insulin resistance in male mouse offspring fed a high-fat diet[J]. Int J Mol Sci，2014，15（4）：6298-6313.

[12] Yajnik CS，Deshpande SS，Jackson AA，et al. Vitamin B12 and folate concentrations during pregnancy and insulin resistance in the offspring：The Pune Maternal Nutrition Study[J]. Diabetologia，2008，51（1）：29-38.

[13] Li X，Jiang J，Xu M，et al. Individualized supplementation of folic acid according to polymorphisms of methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR）， methionine synthase reductase（MTRR） reduced pregnant complications[J]. Gynecologic and Obstetric Investigation，2015， 79（2）：107-112.

[14] 梅慶步，陳萍，鄭立紅. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性與2型糖尿病相關(guān)性研究[J].中國(guó)醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2012， 9（22）：162-163.

[15] Benrahma H，Abidi O，Melouk L，et al. Association of the C677T polymorphism in the human methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） gene with the genetic predisposition for type 2 diabetes mellitus in a Moroccan population[J]. Genetic Testing & Molecular Biomarkers，2012， 16（5）：383.

[16] 周佳菁，袁箐，韓峻松，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性的臨床應(yīng)用研究進(jìn)展[J].醫(yī)學(xué)綜述，2018，24（7）：1266-1272.

[17] Liew SC，Gupta ED. Methylenetetrahydrofolate reductase（MTHFR） C677T polymorphism：Epidemiology，metabolism and the associated diseases[J]. European Journal of Medical Genetics， 2015，58（1）：1-10.

[18] Al-Achkar W，Wafa A，Ammar S，et al. Association of methylenetetrahydrofolate reductase C677T and A1298C gene polymorphisms with recurrent pregnancy loss in syrian women[J]. Reproductive Sciences（Thousand Oaks，Calif），2017，24（9）：1275.

[19] 張巧慧，柳潔. 2型糖尿病患者腔隙性腦梗死與亞甲基四氫葉酸基因C677T多態(tài)性的關(guān)系[J]. 實(shí)用醫(yī)技雜志，2016，23（3）：272-274.

[20] 羅淑靜，楊慧霞. 晚期糖基化終末產(chǎn)物及其受體在妊娠期糖尿病孕鼠的子鼠腦損傷中的作用[J]. 中華婦產(chǎn)科雜志，2012，47（5）：364-367.

[21] 鄒宇潔，常碩，龐湘力，等. 亞甲基四氫葉酸還原酶基因C677T多態(tài)性與男性不育的相關(guān)性及機(jī)制研究[J]. 生殖醫(yī)學(xué)雜志，2017，26（12）：1177-1181.

[22] 張良峰，王新，李海燕，等. N5，N10-亞甲基四氫葉酸還原酶基因多態(tài)性及血漿同型半胱氨酸與冠心病的關(guān)系[J]. 中國(guó)動(dòng)脈硬化雜志，2016，24（10）：1023-1026.

[23] 程立子，王冬娥，葉貴誠(chéng)，等. 同型半胱氨酸及C667T基因多態(tài)性與妊娠期糖尿病關(guān)系分析[J]. 國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志，2016，37（6）：736-737.

（收稿日期：2019-07-12）