H2O2誘導H9c2細胞凋亡中circNFIX表達及作用

崔向倫　蔣梅青　楊維維　劉格格　孫淑琦　徐文華

[摘要]目的 探討環狀RNA NFIX（circNFIX）在H9c2細胞凋亡中的表達趨勢和功能。方法 將H9c2細胞應用200 μmol/L的H2O2孵育0、1、3、6、12 h，應用熒光定量PCR方法檢測H2O2誘導的H9c2細胞凋亡中circNFIX的表達趨勢。將H9c2細胞分為空白對照組（未轉染）、siRNA陰性對照組（轉染siRNA陰性對照組）和siRNA組（轉染siRNA），應用熒光定量PCR方法檢測siRNA對circNFIX抑制效果。將H9c2細胞分為對照組（未轉染）、H2O2組（應用200 μmol/L H2O2孵育12 h）、H2O2+NC組（先轉染siRNA陰性對照，余處理同H2O2組）和H2O2+siRNA組（先轉染siRNA，余處理同H2O2組），用TUNEL和Western blot方法檢測敲低circNFIX對H9c2細胞凋亡的影響。結果 circNFIX表達趨勢檢測顯示，隨著H2O2孵育時間的延長，circNFIX的表達水平逐漸下降（F=23.677，P<0.01）;轉染siRNA可顯著降低circNFIX的表達水平（F=424.70，t=24.44～25.97，P<0.01）。TUNEL和Western blot檢測結果表明，轉染siRNA使TUNEL陽性細胞率和Bax/Bcl-2表達水平顯著降低（t=3.27～17.22，P<0.01）。結論 在H2O2誘導的H9c2細胞凋亡中circNFIX的表達水平減低，沉默circNFIX的表達抑制H9c2細胞凋亡。

[關鍵詞] RNA，環狀;過氧化氫;氧化性應激;細胞凋亡;心肌梗死

[中圖分類號] R329.25 [文獻標志碼] A [文章編號] 2096-5532（2020）04-0389-05

doi：10.11712/jms.2096-5532.2020.56.091

[網絡出版] http：//kns.cnki.net/kcms/detail/37.1517.R.20200519.1427.001.html;2020-05-20 08：53

EXPRESSION AND ROLE OF circNFIX IN H2O2-INDUCED H9C2 CELL APOPTOSIS

CUI Xianglun， JIANG Meiqing， YANG Weiwei， LIU Gege， SUN Shuqi， XU Wenhua

（Department of Inspection， The Medical Faculty of Qingdao University， Qingdao 266071， China）

[ABSTRACT]Objective To investigate the expression tendency and role of circular RNA NFIX （circNFIX） in H9c2 cell

apoptosis.Methods H9c2 cells were incubated with 200 μmol/L H2O2 for 0， 1， 3， 6， or 12 h. Quantitative real-time PCR （qPCR） was used to determine the expression tendency of circNFIX in H2O2-induced H9c2 cell apoptosis. H9c2 cells were divided into blank control group （without transfection）， siRNA negative control group （siRNA-transfected negative control group， NC group）， and siRNA group （siRNA-transfected group）. qPCR assay was used to determine the inhibitory effect of siRNA on circNFIX. The H9c2 cells were divided into control group （without transfection）， H2O2 group （incubated with 200 μmol/L H2O2 for 12 h）， H2O2+NC group （first transfected with NC， followed by the same treatment as the H2O2 group）， and H2O2+siRNA group （first transfected with siRNA， followed by the same treatment as the H2O2 group）. Terminal deoxynucleotidyl transferase-mediated dUTP nick-end labeling （TUNEL） and Western blot were used to determine the effect of circNFIX knockdown on H9c2 cell apoptosis. Results The testing results of circNFIX expression tendency suggested that the expression level of circNFIX was gradually down-regulated with increasing H2O2 incubation time （F=23.677，P<0.01）; the expression level of circNFIX was significantly reduced after siRNA transfection （F=424.70，t=24.44-25.97，P<0.01）. The results of TUNEL and Western blot indicated that siRNA transfection significantly reduced the proportion of TUNEL-positive cells and Bax/Bcl-2 levels （t=3.27-17.22，P<0.01）.Conclusion In H2O2-induced H9c2 cell apoptosis， circNFIX expression is gradually down-regulated， and silencing circNFIX expression inhibits H9c2 cell apoptosis.

[KEY WORDS] RNA， circular; hydrogen peroxide; oxidative stress; apoptosis; myocardial infarction

心肌梗死是一種缺血性心臟病，在全球有較高的發病率和死亡率[1-2]。隨著溶栓和經皮冠狀動脈介入治療的應用，心肌梗死病人的存活率顯著提高。然而，再灌注過程中超氧化物過載和鈣穩態失調使線粒體膜通透性轉換孔開放，進而引起心肌細胞凋亡[3]。凋亡的心肌細胞將被成纖維細胞代替，進而導致左心室的收縮功能障礙，最終發展為心力衰竭[4]。因此，亟需研究和明確心肌細胞凋亡的分子

機制。環狀RNA是一類閉合環狀的分子，具有保守性好、穩定性高、組織特異性和疾病發展階段特異性等特征[5]。環狀RNA有多種生物學功能，參與神經系統疾病和腫瘤等疾病的發病過程[6-7]。最近研究結果顯示，環狀RNA在心血管疾病的發生發展中發揮至關重要的作用[8]，而其在心肌細胞凋亡中的作用尚不明確。本研究探討環狀RNA NFIX（circNFIX）在H9c2細胞凋亡中的變化趨勢和作用，為開發環狀RNA相關的診斷標志物和治療靶標提供實驗依據。

1 材料和方法

1.1 細胞與試劑

大鼠心肌細胞H9c2購自中國科學院（上海）細胞庫;DMEM高糖培養基購于美國GIBCO公司;胎牛血清購于上海吉泰依科賽生物科技有限公司;青霉素/鏈霉素混合液購于北京索萊寶科技有限公司;Trizol試劑、反轉錄試劑和SYBR green購于寶生物工程有限公司;Lipfectamine 3000購于賽默飛世爾科技公司;熒光定量PCR引物購于華大基因公司;siRNA和陰性對照（NC）購于上海吉瑪制藥技術有限公司;TUNEL細胞凋亡檢測試劑盒購于上海翊圣生物科技有限公司;RIPA裂解液（高強度）、PAGE凝膠快速制備試劑盒（125 g/L）、Omni-ECL超靈敏化學發光檢測試劑盒購于上海雅酶生物科技有限公司;Bax、Bcl-2抗體購于沈陽萬類生物科技有限公司;GAPDH抗體、羊抗兔二抗和羊抗鼠二抗購于武漢愛博泰克生物科技有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養 大鼠心肌細胞H9c2培養于含體積分數0.05 CO2、37 ℃濕潤的細胞培養箱中，應用含有體積分數0.10胎牛血清和體積分數0.01青霉素/鏈霉素混合液的DMEM高糖培養基進行培養。培養基每48 h更換1次，取對數生長期的細胞進行實驗。

1.2.2 熒光定量PCR檢測環狀RNA和NFIX mRNA的表達 用Trizol法提取細胞總RNA，具體步驟參照Trizol試劑說明書。反轉錄按照反轉錄試劑說明書進行，反應條件為：37 ℃、15 min，85 ℃、5 s，4 ℃結束。熒光定量PCR的反應條件為：95 ℃預變性3 min，95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，用2-△△CT法計算circNFIX的表達水平。每個樣品設置3個復孔。引物序列見表1。1.2.3 候選環狀RNA表達檢測 選擇對數生長期的H9c2細胞，分為對照組（無藥物處理）、H2O2組（200 μmol/L H2O2孵育12 h）。收集細胞后，用1.2.2的方法檢測候選環狀RNA的表達水平。

1.2.4 circNFIX表達趨勢檢測 取對數生長期的H9c2細胞，分為0 h組（無藥物處理）、1 h組（應用200 μmol/L H2O2孵育1 h）、3 h組（200 μmol/L H2O2孵育3 h）、6 h組（200 μmol/L H2O2孵育6 h）、12 h組（應用200 μmol/L H2O2孵育12 h）。各組處理相應時間后收集細胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX的表達水平。

1.2.5 siRNA轉染效果檢測 取對數生長期的H9c2細胞分為空白對照組（未轉染）、siRNA陰性對照組（轉染NC）、siRNA組（轉染siRNA）。轉染步驟按照Lipfectamine 3000說明書進行，轉染24 h后收集各組細胞，用1.2.2的方法檢測circNFIX和NFIX mRNA的表達水平。siRNA序列見表1。

NC組（先轉染NC，其余處理同H2O2組）、H2O2+siRNA組（先轉染siRNA，其余處理同H2O2組）。轉染24 h后，除對照組外均加入H2O2（終濃度為200 μmol/L），繼續培養12 h。按照TUNEL檢測試劑盒說明書檢測各組TUNEL陽性細胞率。

1.2.7 Western blot檢測Bax和Bcl-2蛋白的表達

實驗分組及處理方法與1.2.6相同，培養結束以后加入RIPA裂解液提取總蛋白。各組樣品經SDS-PAGE蛋白質電泳后，將蛋白轉移到硝酸纖維素膜上，然后用50 g/L脫脂奶粉室溫封閉2 h。加入一抗（Bax，1∶500;Bcl-2，1∶500;GAPDH，1∶5 000）

4 ℃孵育過夜，然后加入二抗（羊抗鼠二抗1∶5 000;羊抗兔二抗1∶5 000）于室溫孵育1 h，最后用ECL檢測試劑盒顯影。以GAPDH為內參，使用Image J軟件分析條帶的灰度值，結果以目的蛋白條帶灰度值/GAPDH條帶灰度值表示。

以上各指標檢測均重復3次。

1.3 統計學分析

使用SPSS 21.0軟件進行統計學分析，計量資料結果以[AKx-D]±s表示，多組間比較采用單因素方差分析，組間兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結 果

2.1 環狀RNA的篩選和circNFIX的表達趨勢

應用熒光定量RCR檢測H9c2細胞凋亡前后候選環狀RNA的表達水平，結果顯示，circNFIX在H9c2細胞凋亡前后變化最顯著（t=17.535，P<0.01）。見表2。因此，選擇circNFIX做進一步研究。對circNFIX表達趨勢的檢測顯示，0、1、3、6、12 h組circNFIX相對表達量分別為1.00±0.01、0.92±0.06、0.84±0.04、0.79±0.05、0.62±0.02。隨著H2O2處理時間的延長，circNFIX的表達量逐漸減少（F=23.677，P<0.01），其中12 h組較0 h組減少了48%（t=9.074，P<0.01）。表明在H2O2誘導的H9c2心肌細胞凋亡中circNFIX的表達水平明顯下調。

2.2 沉默circNFIX表達對TUNEL陽性細胞率的影響

本文siRNA轉染效果檢測顯示，空白對照組、siRNA陰性對照組、siRNA組circNFIX的表達量分別為1.00±0.03、0.96±0.02、0.34±0.03。與空白對照組和siRNA陰性對照組相比較，siRNA組中circNFIX的表達量下降了66%，差異有統計學意義（F=424.70，t=24.44～25.97，P<0.01）;而siRNA陰性對照組與空白對照組間circNFIX表

達量差異無統計學意義（t=1.537，P>0.05）。此外，空白對照組（1.00±0.05）、siRNA陰性對照組（0.99±0.06）和siRNA組（0.93±0.05）間NFIX mRNA表達量比較差異無統計學意義（F=1.00，P>0.05）。結果表明，siRNA可以特異性地抑制circNFIX的表達。

TUNEL分析結果則表明，對照組、H2O2組、H2O2+NC組、H2O2+siRNA組TUNEL陽性細胞率分別為1.89±0.83、10.23±0.72、9.50±0.37、5.09±0.37。與對照組相比，H2O2組TUNEL陽性細胞率明顯增高（t=13.68，P<0.01），說明H2O2使H9c2細胞的凋亡水平顯著增高。H2O2+siRNA組的TUNEL陽性細胞率較H2O2+NC組減少了38%，差異有顯著性（t=17.22，P<0.01）;H2O2組與H2O2+NC組間的TUNEL陽性細胞率差異無統計學意義（P>0.05）。表明沉默circNFIX可使H2O2誘導的H9c2細胞凋亡減少。見圖1。

2.3 沉默circNFIX對Bax和Bcl-2蛋白表達影響

Western blot結果顯示，與對照組（A組）比較，H2O2組（B組）Bax/Bcl-2明顯增高，說明H2O2使H9c2細胞凋亡水平顯著增加。H2O2+siRNA組（D組）的Bax/Bcl-2值與H2O2+NC組（C組）比較減少45%，差異有顯著性（t=3.27，P<0.05）;H2O2組與H2O2+NC組間Bax/Bcl-2值差異無統計學意義（P>0.05）。表明沉默circNFIX使H2O2誘導的H9c2細胞凋亡減少。見圖2和表3。

3 討 論

環狀RNA分布廣泛，調控機制多樣，可在轉錄水平和轉錄后水平發揮重要作用[9]。環狀RNA的調控機制主要有：①可作為miRNA海綿，進而抑制miRNA的功能并上調其靶蛋白的表達水平[10];②可與RNA結合蛋白（RBP）相互作用，進而改變蛋白的亞細胞定位或作為支架促進蛋白間的相互作用[11];③編碼蛋白質，部分環狀RNA具有開放閱讀框（跨越剪接位點）和轉錄起始元件（核糖體插入位點或m6A修飾位點），可編碼新型功能蛋白質[12]。凋亡又稱程序性細胞死亡，是心肌梗死過程中心肌細胞死亡的主要形式之一[13]。氧氣供應不足和氧化應激水平增加均會引起心肌細胞凋亡[3]，減少其凋亡水平有助于保護病人心功能和改善預后。已有研究結果顯示，環狀RNA調控多種心血管疾病的發生發展[8]，如自噬相關環狀RNA ACR通過靶向Pink1介導的FAM65B磷酸化來抑制自噬和心肌梗死[14];敲低[STBX]circSlc8a1可緩解壓力過載誘導心肌circAmotl1可結合PDK1和AKT，在多柔比星誘導的心肌病中起保護作用[16]。然而，環狀RNA在心肌細胞凋亡中的調控作用仍不清楚。本研究旨在篩選心肌細胞凋亡相關的環狀RNA并研究其作用，以進一步明確心肌細胞凋亡的分子機制。

環狀RNA具有穩定的環形結構和較長的半衰期[5]，可在血漿和唾液等體液中被檢測到[17-18]，并且在外泌體中表達豐富[19]。血漿中環狀RNA的表達量與原位組織中表達有相同的趨勢，而且具有疾病發展階段特異性等特征[17]。因此，環狀RNA有潛力成為疾病的診斷標志物。本研究按照以下標準篩選環狀RNA：①在心臟中高表達;②在大鼠和人之間高度保守;③在心肌細胞凋亡前后表達水平發生明顯變化。根據此標準可篩選出高保守性的、心肌細胞凋亡相關的環狀RNA，并具有較好的臨床轉化潛質。檢測血漿或外泌體中circNFIX的表達或可用于心肌梗死診斷和病情監測。

在疾病過程中升高的環狀RNA可促進疾病的發生發展，而下調的環狀RNA可以發揮抑制或者保護的效應。有研究結果顯示，在結腸癌組織中上調的circPPP1R12A可促進結腸癌細胞的增殖、遷移和侵襲[20];在口腔鱗狀細胞癌組織和細胞中下調的circRNA_0000140可抑制口腔鱗狀細胞癌的生長和轉移[21]。然而，部分環狀RNA因發生應激性變化，其表達與功能呈負相關。研究顯示，在缺血的心肌組織和低氧的心肌細胞中上調的circTtc發揮心臟保護作用[22]。本文研究結果顯示，circNFIX在心肌細胞凋亡中有減少趨勢，但其發揮促凋亡的作用，可能是受RBP、增強子等上游因子調控的結果。circNFIX的上游調控機制需要進一步研究。

miRNA海綿和結合RBP是環狀RNA發揮作用的主要機制，探討circNFIX下游的miRNA或RBP有助于明確其作用機制。而通過starBase數據庫預測可能與circNFIX結合的miRNA，發現miR-204和miR-145與心肌細胞凋亡相關[23-25]。其中，miR-204在缺血再灌注的心肌組織中顯著下降，可減少低氧/復氧誘導的H9c2細胞凋亡;而miR-145可抑制低氧或H2O2誘導的H9c2、HL-1和新生小鼠心肌細胞的凋亡[24-25]。另外還有研究結果顯示，circNFIX可與凋亡相關的IDH2和hnRNPK結合[26]。在IDH2缺陷的小鼠中，超氧化物的產生和凋亡蛋白的表達增加，并伴隨著線粒體功能障礙[27]。沉默IDH2可抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡[28]。在膀胱癌中，hnRNPK可抑制細胞凋亡和促進細胞增殖[29]。circNFIX是否通過調控這些miRNA或RBP發揮作用有待進一步研究。

綜上所述，在H2O2誘導的H9c2細胞凋亡中circNFIX表達呈下降趨勢，沉默circNFIX可以抑制H2O2誘導的H9c2細胞凋亡。circNFIX有潛力成為心肌梗死的診斷標志物和治療靶點。

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（本文編輯 黃建鄉）

[收稿日期]2019-12-24; [修訂日期]2020-03-31

[基金項目]國家自然科學基金項目（81770900），山東省科技發展基金項目（2014GHY115025）

[第一作者]崔向倫（1995-），男，碩士研究生。

[通信作者]徐文華（1971-），女，博士，教授，碩士生導師。E-mail：qd.wh@163.com。