蜂毒前溶血肽原重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PPMel的構建及分析

郭新軍

(西安文理學院 生物與環(huán)境工程學院，陜西 西安 710065)

作為蜂毒的主要活性成分之一[1]，蜂毒肽(Melittin)在蜜蜂體內(nèi)是由其前體——蜂毒溶血肽原(Promelittin)水解而成的[2]，而蜂毒溶血肽原是蜂毒前溶血肽原(Prepromelittin)加工后的產(chǎn)物。蜂毒前溶血肽原包括70個氨基酸殘基，由信號肽(第1至第21氨基酸殘基)、低復雜性區(qū)域(第22至第43氨基酸殘基)和蜂毒肽結構域(第44至第69氨基酸殘基)等構成[3]。

利用基因工程技術生產(chǎn)蜂毒肽被看作一條有效獲得蜂毒肽的途徑，具有一定應用前景。前期我們構建了蜂毒前溶血肽原與GST融合表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel，并在大腸桿菌BL21感受態(tài)細胞中誘導表達，成功獲得了目的融合蛋白。但由于GST標簽自身相對分子質(zhì)量較大，而目的蛋白又非常小，對目的片段的純化等可能會有較大影響。筆者研究考慮到蜂毒前溶血肽原自身具有較大的溶解度，對細胞膜的破壞能力較低，嘗試使用分子量較小的His標簽，將改造后的蜂毒前溶血肽原基因由重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel重構到pET-28a(+)載體上，構建了pET-28a(+)-PPMel重組質(zhì)粒，并對其進行生物信息學方面分析，為探討其在原核細胞中的表達提供基礎。

1 材料和方法

1.1 實驗材料與主要試劑

實驗室前期對蜂毒前溶血肽原基因進行了改造并合成了改造后的基因，構建了蜂毒前溶血肽原與GST融合表達重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel。相關材料保存于本實驗室。

實驗所用pET-28a(+)表達載體、大腸桿菌(E. coli)TOP10感受態(tài)細胞及T4 DNA連接酶、限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI等分子生物學試劑均由生工生物工程(上海)股份有限公司提供。

1.2 實驗方法

1.2.1 蜂毒前溶血肽原基因載體更換 利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI對原構建的重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel進行雙酶切，同時利用限制性內(nèi)切酶EcoRI和SalI對載體pET-28a(+)進行雙酶切。各酶切體系(50 μL)中均包含反應模板4 μg，10×FD Buffer 5 μL，SalI 1 μl(10 U·μL-1)，EcoRI 1 μl(10 U·μL-1)，ddH2O 39 μL。酶切體系置于恒溫水浴鍋中37 ℃條件下反應2 h。

回收目的基因片段和酶切后的載體pET-28a(+)，利用T4 DNA連接酶將獲得的目的基因片段與酶切后的載體pET-28a(+)進行連接，獲得重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PPMel(圖1)。連接體系(20 μL)中包含目的基因片段8 μL，酶切后載體pET-28a(+) 4 μL，10×T4 DNA ligase Buffer 2 μL，T4 DNAigase 1 μL(5 U·μL-1)，ddH2O 補充至20 μL。上述連接混合液置于PCR儀中22 ℃條件下反應1 h。

將獲得的重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌TOP10感受態(tài)細胞，經(jīng)含有50 μg·mL-1卡那霉素的平板培養(yǎng)過夜后篩選陽性克隆，提取重組質(zhì)粒進行酶切、電泳鑒定，并委托生工生物工程(上海)股份有限公司測序進行驗證。

1.2.2 目的產(chǎn)物的生物信息學分析 應用ExPASy ProtParam tool(web.expasy.org/protparam/)對目的融合蛋白產(chǎn)物的理化性質(zhì)進行分析[4]。通過SignalP-5.0 Server程序(www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)對目的融合蛋白進行信號肽分析[5]。同時，通過TMHMM Server v.2.0(www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)對目的融合蛋白進行跨膜區(qū)域分析。

2 結果與分析

2.1 重組質(zhì)粒的酶切檢測

從大腸桿菌中提取的重組質(zhì)粒，酶切后進行電泳檢測。根據(jù)電泳結果可知，重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRI和SalI雙酶切后的產(chǎn)物主要為約5 000 bp和200 bp的兩個片段(圖2)。片段大小與預期一致，可知原重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因片段已成功重構于新的載體pET-28a(+)上，獲得的酶切片段中，大片段為載體質(zhì)粒，小片段為插入的蜂毒前溶血肽原基因片段。

2.2 重組質(zhì)粒插入片段的測序結果

插入片段的測序結果與預定改造后的蜂毒前溶血肽原基因序列一致(圖3)，進一步驗證了目的基因已成功插入到載體中。序列兩端分別包含EcoRI和SalI酶切位點，保證了目的片段以正確的方向插入到載體中。

2.3 目的產(chǎn)物的生物信息學分析

插入載體后的蜂毒前溶血肽原可與載體上的相關序列連接在一起進行融合表達，且目的基因片段能與pET-28a(+)載體中的前端序列形成正確的讀碼框，起始密碼子來自載體，終止密碼子來自目的基因末端。表達的融合蛋白包括106個氨基酸殘基，比設計的蜂毒前溶血肽原多36個氨基酸殘基，包括6個組氨酸殘基組成的His標簽。蜂毒肽序列前的N-G氨基酸殘基構成羥胺裂解位點[6]，可作為由融合蛋白獲得蜂毒肽的切割位點(圖4)。該融合蛋白的理論等電點(Theoretical pI)為6.35，帶負電荷氨基酸殘基10個，帶正電荷氨基酸殘基8個，融合蛋白不穩(wěn)定系數(shù)較蜂毒前溶血肽原略有降低。

蜂毒前溶血肽原本身具有信號肽[3]，在真核細胞內(nèi)可進行分泌表達。在進行融合表達時，蜂毒前溶血肽原N末端添加相應序列后，融合蛋白沒有明顯信號肽。信號肽的這種變化對于在原核表達系統(tǒng)中表達真核細胞基因的影響有待于進一步研究。

蜂毒前溶血肽原融合蛋白存在兩個跨膜區(qū)，主要在融合蛋白的中間區(qū)域和C末端(蜂毒肽結構域)。

3 討論

蜂毒肽在抗菌、消炎、抗腫瘤、肌肉再生[7～12]等方面具有一定的應用價值。在利用基因工程方法生產(chǎn)蜂毒肽時，可考慮用蜂毒前溶血肽原作為表達的初始產(chǎn)物，進一步在體外加工而獲得蜂毒肽。因為與蜂毒肽相比，蜂毒前溶血肽原具有較大的溶解度，且對細胞的破壞能力小[13]。

蜂毒前溶血肽原基因全長CDS序列僅213 bp，用人工合成的方法獲得全序列較為方便，且易根據(jù)需要對基因進行改造。合成的基因序列可以根據(jù)需要構建到載體上，進行復制、表達或保存。也可以在需要時利用酶切和連接技術更換載體。為了實現(xiàn)改造后的蜂毒前溶血肽原基因與His標簽等序列的融合表達，我們將原連接于重組質(zhì)粒pGEX-4T-1/PPMel中的蜂毒前溶血肽原基因進行了換載重構，并成功獲得了重組質(zhì)粒pET-28a(+)-PPMel，為進一步轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細胞并進行蜂毒前溶血肽原基因的表達提供了材料。

通過對相關序列的生物信息學分析，在進行融合表達時，表達出的融合蛋白與蜂毒前溶血肽原相比，其理化性質(zhì)、信號肽等均發(fā)生一定的變化，這種變化對于其原核表達的影響有待于進一步研究。蜂毒前溶血肽原本身存在2個跨膜區(qū)，在進行原核表達時，可能不利于其在細胞內(nèi)的表達。若要減少跨膜區(qū)，可考慮進一步對融合蛋白中間跨膜區(qū)對應的基因序列進行改造，而考慮到要保證通過原核表達產(chǎn)物獲得的蜂毒序列不變，融合蛋白中蜂毒肽結構域的跨膜區(qū)無法去除。獲得的重組質(zhì)粒在進行表達時，仍需進一步摸索條件，以便順利表達出目的蛋白，為蜂毒肽的生產(chǎn)提供基礎。