高烏甲素的提取及在比格犬體內的藥代動力檢測

趙詠梅,馬三平,王樂融

(西安文理學院 生物與環境工程學院，陜西 西安 710065)

高烏頭(AconitumsinomontanumNakai)為毛茛科毛茛屬植物，藥用歷史悠久中醫常以高烏頭根入藥，用以治心悸、胃氣痛、跌打損傷等癥[1]。高烏頭中主要含有二萜類生物堿，以C-18 型二萜生物堿高烏甲素居多[2]。高烏甲素化學式C32H44N2O8，分子量584.64，外觀白色晶體[3]。

高烏甲素具有較強的鎮痛作用，維持時間較長，且無成癮性，不會發生蓄積中毒，臨床常以高烏甲素的氫溴酸鹽用于癌癥患者輕、中度疼痛的治療和術后痛的治療[4～6]。研究證明，腹腔注射或灌胃給予高烏甲素均能明顯提高小鼠、大鼠的痛閾，其鎮痛強度約是氨基比林的7倍，且強于吲哚美辛和阿司匹林，灌服給藥比注射給藥藥效明顯延長[7～8]。在大鼠坐骨神經結扎引起的神經病理性疼痛模型上，腹腔注射4 mg·kg-1高烏甲素即可對模型鼠機械痛和熱痛產生顯著鎮痛作用，并且連續給藥3周不產生耐藥性[9]。然而高烏甲素用于寵物犬類的報道卻并不多。

比格犬又名“米格魯獵兔犬”，小型獵犬，一般體重7.1～9.1 kg，是目前實驗研究中使用最多也是最標準的犬類實驗動物，被廣泛用于微生物學、病毒學、生物化學、病理學、藥理學等各類研究工作中[10]。使用比格犬作為實驗動物，探究高烏甲素提取液在藥代動力學方面的性質，旨在為高烏甲素在大型實驗動物內的臨床研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 植物材料與標準品 采自河北的野生高烏頭根，取250g左右備用。經西安鴻生生物科技有限公司測定，藥材中高烏甲素含量平均值為0.78%。98%高烏甲素標準品(成都普菲德生物技術有限公司)。

1.1.2 實驗動物 比格犬3只，由上海睿智化學研究有限公司大動物研究中心提供，編號#1 、#2、#3 (合格證號SCXK(京)2011-0003 11400600000852)，普通級雄性，體重8.1～8.4 kg。

飼養條件:動物房控制室溫范圍是20.0～26.0℃，相對濕度控制在30%～70%范圍內，光照12 h明暗交替，動物清洗期兩周。犬飼料購買自北京科澳協力飼料有限公司，檢驗合格。試驗期間每天給予動物飼料2次(上午和下午各1次，每次約100 g·只-1)，動物自由攝水。

1.1.3 試劑 無水乙醇(分析醇),色譜甲醇，乙胺，EDTA-K2，純凈水，等。

1.1.4 主要儀器與設備 箱式微波干燥設備(天水華圓制藥設備科技有限公司)；循環水式真空泵(北京中興偉業儀器有限公司)； 萬能高速粉碎機(上海菲力博食品機械有限公司功率: 2 300 W 轉速：25 000 r；(日本島津公司)SPD-20A高效液相色譜儀；Eppendorf 5415R型臺式低溫離心機(艾本德中國有限公司)；XW-80A漩渦混合儀(海門市其林貝爾儀器制造有限公司)；20～200 μL移液槍(Thermo)；YP100K-5型電子天平(上海良平儀器儀表有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 回流提取高烏甲素 粉碎高烏頭根，用60目篩網篩濾2～3次，將細粉混勻取150 g左右備用。連接好回流裝置，用75%的乙醇，以1∶10的物料比回流提取2兩次，每次回流2 h。

回流結束后取出蒸餾燒瓶冷卻至室溫，而后真空抽濾，濃縮，真空干燥8 min，得到粗提物，將其研磨成細粉裝入自封袋中，待測。

1.2.2 提取物中高烏甲素含量的測定 精確稱量樣品10.0 mg倒入100 mL容量瓶中，加20 mL甲醇(色譜醇)，超聲溶解，冷卻至室溫，用甲醇(色譜醇)定容，搖勻備用。高效液相色譜檢測條件為，色譜柱:Phenomenex C18柱( 150 mm ×4.6 mm，5 μm)；流動相：色譜甲醇(0.1 mol·L-1NaH2PO4)=72∶28(V/V)；檢測波長:254 nm；柱溫：30℃；流速：1.0 mL·min-1；進樣量20 μL；檢測時長：30 min。

樣品計算方法：樣品含量=(樣品峰面積×對照濃度)/(對照峰面積×樣品濃度)×100%×對照含量。

1.2.3 動物樣品采集及處理 參考高烏甲素在人體內的用量，以不同物種、大小動物體表面積系數為依據，近似推算，選用劑量0.5 mg·kg-1。從靜脈近心端使血管突起處給藥2.03、2.05、2.11 mL[11]。采集給藥前(0h)，給藥后0.083 h(5 min)、0.25 h、0.5 h、1 h、2 h、4 h、8 h、24 h時間點血液各0.5 mL，采集位置為比格犬未給藥的前肢橈靜脈。將采集到的血液轉移到上述準備的離心管中，震蕩倒置至血液與15%EDTA-K2抗凝劑混合均勻。低溫離心機4℃、3 000 g離心5 min，吸取上清液200 uL，轉移至血漿收集離心管中，干冰-79℃冷凍保存，等待分析。

1.2.4 樣品檢測及數據分析 血藥樣品由上海睿智化學研究有限公司進行檢測，使用WinNonlin 6.2藥學分析軟件進行分析，對得到的血藥濃度-時間數據，分別使用房室模型及非房室模型進行分析[12]。

2 結果

2.1 高烏甲素液相色譜結果

高烏頭細粉以75%乙醇為提取液，經回流提取濃縮干燥后，得到樣品。經液相色譜檢測，得到圖1和圖2。高烏甲素標品的液相色譜最高峰出現在11.932 min，峰面積為1 057 900.250(圖1)；高烏甲素實驗樣品最高峰出現在11.798 min，峰面積為172 396.000(圖2)。經計算，樣品高烏甲素含量為4.21 mg·g-1。

圖1 高烏甲素標準品檢測

圖2 高烏甲素實驗樣品檢測

2.2 比格犬血藥濃度-時間曲線

通過對比格犬0 min，5 min，15 min，30 min，1 h，2 h，4 h，8 h，24 h的血漿樣品進行分析，得到結果如下：

表1 比格犬各時間點血藥濃度

圖3 比格犬血藥濃度-時間

2.3 房室模型計算藥代動力學參數

藥物在體內代謝的動態變化過程一般相當復雜，故為方便研究必須將復雜的機體系統進行簡化，就是通過建立簡化的模型，再用相應相關數學公式進行具體的描述。在這種模型中機體被視為一個系統，并按照各組織器官等不同的動力學特點劃分為若干個隔室，因而稱其為隔室模型。每種隔室將機體內代謝速率相同或近似的器官、組織歸為一類，進行藥代動力學計算。一般常用的有一室模型和二室模型。

對三只比格犬的血藥濃度-時間數據分別以一室模型、二室模型進行擬合，使用AIC方法(AIC，Akaike Information Cterion，是衡量統計模型擬合優良性的一種標準，值越小則擬合程度越高)判斷擬合度。一室模型AIC值分別為62.45069、67.85479、61.75113，二室模型AIC值分別為53.46675、22.10481、42.39236，二室模型AIC值顯著低于一室模型，因而選用二室模型進行分析。

表2 二室模型下比格犬藥代動力學參數

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲線下分布面積)，K10-HF(K10，從中間室消除的表觀一級速率常數，K10-HF，中間室消除半衰期)，Alpha(fast disposition rate constant，α，二室模型中描述藥物在體內分布的表觀一級混合速率常數)，Beta(slow disposition rate constant，β，二室模型中描述藥物消除的表觀一級混合速率常數)，Alpha_HL(分布相的半衰期)，Beta_HL(消除相的半衰期)，Cmax(按模型推算出的給藥后的最大血藥濃度)，CL(清除率，單位時間內清除藥物的血漿容積)，AUMC(一階矩，時間和血藥濃度的乘積與時間曲線的下面積)，MRT(Mean Residence Time， MRT，平均滯留時間)，Vss(表觀穩態分布容積)，CLD(血漿藥物透析清除率)。經檢測，公式參數分別為：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593。

經計算，平均藥代動力學公式為

C=98.925205e^(-4.038817*t)+79.244653e^(-0.234683*t)

2.4 非房室模型計算藥代動力學參數

非房室模型在計算藥代動力學參數時不依賴于隔室模型，而是以藥物濃度-時間曲線下面積作為主要計算依據，不受數學模型的限制，故又稱為非隔室分析法(nonconpartment analysis)。該方法計算簡便，且適用于緩控釋制劑的藥代動力學研究。計算得到參數如下：

表3 非房室模型下比格犬藥代動力學參數

HL_Lambda_z( half-life，HL，血漿半衰期)：藥物在血漿中最高濃度降低一半所需的時間。不同藥物的HF相差很大，一般常用的藥物按照HF的長短可以分為5類，超快速消除類(HF≤1 h，如青霉素，甲氧西林、萘夫西林等)、快速消除類(HF=1～4 h，如氨芐西林，頭孢唑林，克林霉素等)、中速消除類(HF=4～8 h，如林可霉素，土霉素、丙磺舒等)、慢速消除類(HF=8～24 h，如多西環素、美他環素、磺胺嘧啶等)以及超慢速消除類(HF>24 h)。

AUC(area under the time concentration curve，AUC，曲線下分布面積)，AUClast指的從給藥時間開始到最后一個點的這段時間的AUC，均值為354 ± 37.6 h*ng·mL-1，AUCINF_obs指的從給藥開始到理論外推無窮遠的時間的AUC)：代表著被吸收到體內的總藥量，均值為430 ± 42.7 h*ng·mL-1。Vss(total volume of distribution，分布容積)：當血漿和組織內藥物分布達到平衡后，體內藥物按此時的血漿藥物濃度在體內分布所需要的體液容積，實驗測得Vss均值為5.13±0.560 L·kg-1。

3 討論

高烏甲素因其有強效鎮痛，降溫抗炎，增強人體免疫力，不會成癮，沒有致突變和致癌風險等特點，在醫藥學方面有著非常重要的作用。而關于高烏甲素的鎮痛機制研究較多，但說法不一。有研究認為高烏甲素參與阻斷電壓門控的鈉離子通道，通過減少鈉離子內流并阻斷延遲性鉀離子內流，來抑制動作電位的產生而起到鎮痛作用[13～14]。還有一些報道認為高烏甲素的鎮痛作用與甲腎上腺素和五羥色胺下行抑制系統有關[15～17]。關于高烏甲素在動物體內的藥代動力學研究，目前的研究多集中于大鼠和小鼠[18]，而在大型動物體內的研究還較少。

在筆者實驗中，按照非房室模型數據，比格犬靜脈注射高烏甲素提取液0.5 mg·kg-1，分布容積Vss為5.13 ± 0.560 L·kg-1，理論上藥物全部進入血液中，Vss約為0.1L·kg-1，大于此值，即代表相對血藥濃度越低，藥物可能在某些器官組織中有富集，得值遠大于0.1 L·kg-1，即代表此藥物在器官內有明顯的富集現象，而具體在哪些器官中富集，仍需要進一步實驗探究。AUClast和AUCINF分別為354 ± 37.6和 430 ± 42.7 h·ng-1·mL-1，以此為參照，可以計算同等劑量其他給藥方式的生物利用度F。MRTlast和MRTINF_obs分別為2.586±0.05529和4.38175±0.127。半衰期HF為 3.31 ± 0.155 h，代謝速度屬于快速消除，藥效時間相對較短，作為鎮痛藥品，可能難以滿足寵物犬的臨床使用。但因為是血管內途徑給藥，藥物直接進入血液，沒有吸收過程，所以應考慮其他吸收較慢的給藥方式，如皮下注射、肌肉注射或靜脈滴注等，或考慮其他劑型如載體制劑、緩控釋制劑等，增加半衰期HF，提高有效血藥濃度時間。

比格犬靜脈注射高烏甲素0.5mg·kg-1，按照二房室模型數據，公式參數分別為：α=4.935±0.896，β=0.213±0.022，A=113.623±74.279，B=83.267±71.9593，以此模型可以為其他相關研究提供參考。