熒光標記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術快速檢測雞肉中沙門氏菌

孟圓圓，劉麗莉，楊曉盼，代曉凝，陳珂

(河南科技大學 食品與生物工程學院,食品加工與安全國家級教學示范中心,河南 洛陽，471023)

沙門氏菌是一種在自然界中普遍存在，能在人和動物的腸道內寄生并引起人畜共患病和食物中毒，嚴重威脅人和動物生命健康的革蘭氏陰性致病菌[1]。已知沙門氏菌有2 600多個血清型，具有菌種種類多、分布廣且具有地域性、危害大等特點[2]，該菌的傳播媒介主要通過畜禽肉(尤其是雞肉)、禽蛋、奶及海產品等營養豐富的食物進行傳播，極易污染水源，每年由其所引起的細菌性食物中毒事件約占其他食源性病原菌的40%，在我國乃至世界全球范圍內一直高居首位[3]。

目前，用于檢測沙門氏菌的方法主要包括傳統培養法、分子生物學方法和免疫學方法[4]。作為“金標準”的傳統培養法，需要進行前增菌、分離、生化試驗和血清學鑒定等處理，雖結果可靠性強，但操作步驟繁瑣復雜且耗時耗力，一般需要4～7 d才能得出檢測結果[5]。分子生物學方法如聚合酶鏈式反應[6]、基因芯片技術[7]、環介導等溫擴增技術[8]、生物傳感器技術[9]等具有特異性強、靈敏度高的優勢，但對實驗環境及技術人員要求較高且成本昂貴，難以在現場實現快速檢測及在基層普及[10]；免疫學方法如酶聯免疫吸附法[11]、免疫磁珠分離法[12]、免疫試紙條法[13]等雖重現性較好，但檢出限較高且易交叉污染，檢測結果可能出現假陽性現象[14]。基于以上檢測方法都存在不足之處，因此，開發一種快速、高效、靈敏度高且特異性強的沙門氏菌檢測方法具有重要意義。

近年來，利用熒光標記與磁性納米材料相結合的方法檢測細菌因具有檢測周期短、靈敏度及準確度高而成為當前國內外學者研究的熱點。如車玉蘭[15]分別對大腸桿菌和沙門氏菌的適配體進行熒光標記并與易操控的納米磁富集結合，建立了檢測細菌的高效分析方法及微流控芯片法。LI等[16]建立了一種不同磁性梯度的熒光-磁性納米探針快速分離和檢測多種病原菌的方法。YU等[17]利用基于磁性Fe3O4納米粒子和雜交鏈反應的熒光級聯放大法檢測沙門氏菌，在生菜中檢出限可達6.9×102CFU/g。HU等[18]實驗采用比色-熒光-磁性納米球的多模式平臺檢測沙門氏菌。以上研究主要基于磁性納米粒子與熒光標記相結合的方法對細菌進行檢測，但利用Fe3O4/GO納米復合材料與熒光標記DNA相結合用于檢測沙門氏菌的報道還未出現。

本文通過化學共沉淀法制備Fe3O4/GO，Fe3O4/GO除具有順磁性外，還具備熒光猝滅作用及對單鏈DNA強烈的吸附能力，本研究充分利用Fe3O4/GO和熒光標記DNA探針的優點，采用熒光標記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術對沙門氏菌目標DNA的檢測條件進行了優化，在最優條件下，對人工模擬污染雞肉樣品中的沙門氏菌進行了檢測，得出沙門氏菌菌落總數對數與相對熒光強度F/F0之間的定量關系，建立快速、選擇性好、靈敏度高且特異性強的沙門氏菌檢測新方法，旨在為沙門氏菌的檢測提供理論依據和技術支撐。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

氧化石墨烯，南京先豐納米材料科技有限公司；KH2PO4、Na2HPO4、KCl(分析純)，天津市德恩化學試劑有限公司；NaCl(分析純)，江蘇強盛功能化學股份有限公司；胰蛋白胨、酵母浸膏(生化試劑)，北京奧博星生物技術有限責任公司；沙門氏菌顯色培養基，南通凱恒生物科技發展有限公司；FeCl3、FeCl2，天津市福晨化學試劑廠；氨水(分析純)，上海強順化學試劑有限公司；沙門氏菌(ATCC 14028)、大腸桿菌(ATCC 25922)、金黃色葡萄球菌(CMCC 26003),微生物實驗室老師友情饋贈；所有DNA序列,均由上海生工生物工程股份有限公司合成；細菌基因組DNA提取試劑盒，上海捷瑞生物工程有限公司。

1.2 儀器與設備

DY04-13-44-00型壓力蒸汽滅菌鍋，上海東亞壓力容器制造有限公司；THZ-1038型恒溫培養搖床，上海一恒科學儀器有限公司；DH-600型電熱恒溫培養箱，北京科偉永興儀器有限公司；BBS-V800型潔凈工作臺，濟南鑫貝西生物技術有限公司；BE-1100型四維旋轉混勻器，海門市其林貝爾儀器有限公司； KQ2200型超聲波清洗儀，昆山市超聲波清洗儀；35172 BRUZ型拍擊式均質機，法國AES Chemuex公司；DZKW-S-4型電熱恒溫水浴鍋，北京市永光明醫療儀器有限公司；Cary eclpise型熒光分光光度計，美國安捷倫公司；

1.3 實驗方法

1.3.1 Fe3O4/GO的制備

參考劉闖[19]的方法并改進。采用化學共沉淀法制備Fe3O4/GO，分別取2 g FeCl3和1 g FeCl2加入到100 mL滅菌超純水中，超聲處理2 h得溶液A；取 0.3 g GO加入到100 mL滅菌超純水中，超聲處理4 h得溶液B；將以上2種溶液進行混合，同時加入30%氨水將溶液pH調整為9～10，置于水浴鍋中加熱到90 ℃，同時攪拌至混合物顏色完全變黑，將其從水浴鍋中取出自然冷卻到室溫，然后放入離心機中離心得到黑色固體，用滅菌超純水和無水乙醇洗滌數次至混合物上清液的pH為7左右，再將黑色固體置于 70 ℃的真空干燥箱中烘干，即可制得Fe3O4/GO。

1.3.2 DNA序列設計

本實驗參考相關文獻，采用軟件Primer Premier 5.0對3條DNA序列進行設計，并用Ribosomal Database Project Ⅱ和NCBI Blast 2數據庫提供的Probe Match軟件檢測序列的特異性[5, 20]。設計的DNA序列如表1所示。

表1 探針堿基序列Table 1 Probe base sequence

1.3.3 沙門氏菌目標DNA檢測條件的優化

分別考察Fe3O4/GO質量濃度(4×10-5、8×10-5、1.2×10-4、1.6×10-4、2.0×10-4、2.4×10-4、2.8×10-4、3.2×10-4、3.6×10-4g/mL)、Fe3O4/GO與捕獲探針反應時間(0、3、9、21、24、27、42、60、80、100 min)及反應溫度(31、34、37、40、43 ℃)對熒光猝滅作用的影響。考察DNA探針雜交時間(30、60、90、120、150 min)和富集倍數(1、3、5、7、9倍)對熒光強度的影響。

1.3.4 沙門氏菌目標DNA的檢測

將Fe3O4/GO與捕獲探針在最優條件下進行反應，得到Fe3O4/GO捕獲探針復合物溶液，磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，并用PBS緩沖液清洗磁性顆粒以除去未反應的DNA。然后吸取PBS緩沖液配置的一系列濃度的沙門氏菌目標DNA溶液，以滅菌超純水代替沙門氏菌目標DNA溶液為空白對照，分別加入到磁性顆粒中，在42 ℃條件下反應一定時間以完成部分雜交，然后置于磁場中磁分離10 min，收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應的DNA。再吸取用PBS緩沖液稀釋一定濃度的釋放探針溶液加入到磁性顆粒中，并進行富集，在42 ℃條件下反應2 h，根據堿基互補配對原則完成雜交試驗。完成雜交之后的DNA雙鏈將脫離Fe3O4/GO表面，熒光恢復，再利用磁場磁性分離Fe3O4/GO，并將上清液置于熒光石英比色皿中，在激發波長為λex=495 nm，發射波長λem=517 nm，激發狹縫和發射狹縫均為10 nm條件下，采用熒光分光光度計進行測定，并扣除自身熒光背景吸收，即可對沙門氏菌進行定量分析。

1.3.5 沙門氏菌的培養

用移液搶吸取1 mL實驗室保藏的沙門氏菌菌液于裝有50 mL 滅菌LB營養肉湯培養基的錐形瓶中，置于37 ℃的恒溫培養搖床上振蕩培養過夜，使沙門氏菌菌種分散、活化，并用PBS溶液稀釋至10-1～10-9濃度備用[15]。

1.3.6 人工模擬污染雞肉中沙門氏菌DNA的提取與檢測

人工模擬沙門氏菌污染雞肉參考胡冰雪[21]的方法并加以改進，在無菌條件下，分別取25 g冰鮮雞胸肉與225 mL滅菌營養肉湯培養基進行混合，置于無菌均質袋中37 ℃均質1 min，等量分裝成10份，在離心機中3 000 r/min離心5 min，懸浮液用0.45 μm的濾膜進行過濾，將過濾后的肉湯置于-20 ℃條件下冷藏待用。

分別吸取上述稀釋菌液100 μL于滅菌沙門氏菌顯色培養基上，置于37 ℃的恒溫培養箱中培養24 h，根據平板菌落劃線法算得沙門氏菌數量為2.8×107CFU/mL。用PBS溶液將沙門氏菌的數量稀釋為1.0×101～1.0×107CFU/mL的標準菌液，將所稀釋的標準菌液分別加入到25 mL肉湯中，對照組中加入滅菌的營養肉湯培養基[21-22]。再向以上每份肉湯中加入25 mL滅菌后的營養肉湯培養基，搖勻后置于37 ℃的恒溫振蕩培養箱150 r/min振蕩24 h，吸取1 mL各濃度梯度的菌液用GenerayTMBiotechnology公司生產的細菌基因組DNA提取試劑盒(GK1072)提取沙門氏菌的DNA，并置于95 ℃水浴鍋中5 min，然后在0 ℃條件下冰浴5 min，以打開雙鏈，制備出單鏈DNA作為沙門氏菌目標DNA[22]，利用熒光標記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術對人工模擬污染雞肉中的沙門氏菌進行檢測，得出其最低檢出限及沙門氏菌菌落總數對數與相對熒光強度F/F0之間的定量關系，以此來判斷本方法的準確性和可行性。

1.3.7 特異性分析

為考察所建立檢測方法的特異性，以沙門氏菌為實驗組，大腸桿菌和金黃色葡萄球菌為對照組，利用試劑盒提取其DNA，并進行熒光測定。

1.3.8 數據處理

每組試驗重復3次取平均值，且所有的熒光光譜圖均扣除其背景吸收，采用ChemDraw 18.0軟件繪制示意圖及Origin 8.5軟件對試驗數據進行統計分析并作圖。

2 結果與分析

2.1 實驗原理

當向Fe3O4/GO溶液中加入捕獲探針溶液時，由于捕獲探針單鏈DNA堿基上的C-N雜環與Fe3O4/GO碳六環結構之間存在π-π堆積及靜電引力作用而吸附在Fe3O4/GO表面，此時，標記在捕獲探針一端的6′-FAM熒光素能與Fe3O4/GO之間發生非輻射能量轉移生成復合物而導致熒光猝滅，如圖1-(a)所示。然后通過磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應的DNA，再加入沙門氏菌目標DNA溶液，沙門氏菌目標DNA與捕獲探針的一段DNA進行雜交形成部分雙鏈并脫離Fe3O4/GO表面，如圖1-(b)所示。再次進行磁分離收集磁性顆粒，移除原溶液，除去未反應的DNA，并向磁性顆粒中加入釋放探針溶液，根據堿基互補配對原則完成雜交形成完整的DNA雙鏈并脫離Fe3O4/GO表面，熒光恢復，利用磁場分離Fe3O4/GO，通過檢測上清液熒光強度的變化即可實現對沙門氏菌的快速檢測，如圖1-(c)所示。

圖1 基于熒光標記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術檢測 沙門氏菌DNA的示意圖
Fig.1 Schematic diagram of rapid detection ofSalmonellatarget DNA based on fluorescently labeled DNA-magnetic graphene oxide magnetic separation technology

2.2 沙門氏菌目標DNA檢測條件的優化

2.2.1 Fe3O4/GO質量濃度的優化

由圖2可知，在未加入Fe3O4/GO之前，沙門氏菌捕獲探針在495 nm激發波長下，其熒光發射峰在517 nm處，當沙門氏菌捕獲探針濃度為50 nmol/L時，扣除Fe3O4/GO的背景吸收后，其熒光強度 ΔF=944.92(ΔF=F-FT，其中F為加入沙門氏菌捕獲探針時的熒光強度，FT為未加入沙門氏菌捕獲探針時的熒光強度)，固定沙門氏菌捕獲探針濃度不變，當向其溶液中加入不同質量濃度的Fe3O4/GO后，沙門氏菌捕獲探針的熒光被猝滅，且隨著Fe3O4/GO質量濃度的增加，其熒光強度逐漸減小，熒光猝滅率逐漸增大，當Fe3O4/GO濃度為3.2×10-4g/mL時，熒光猝滅率可達96.86%，表明Fe3O4/GO對沙門氏菌捕獲探針有強烈的熒光猝滅作用。

a-不同質量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅光譜圖; b-不同質量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅率圖
圖2 不同質量濃度Fe3O4/GO的熒光猝滅光譜圖 及熒光猝滅率圖
Fig.2 Fluorescence quenching spectrum and fluorescence quenching rate of different mass concentrations of Fe3O4/GO

2.2.2 反應時間及溫度對熒光猝滅作用的影響

由圖3-a可知，反應時間在0～21 min時，其熒光強度迅速減小，熒光猝滅強度迅速增加，反應時間在60～100 min時，熒光強度幾乎不變，因此Fe3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針最佳反應時間為60 min。

圖3-b為反應溫度對熒光猝滅作用的影響圖，隨著反應溫度的增加，其熒光強度先減小后增加，即熒光猝滅強度先增大后減小，當反應溫度為37 ℃時，熒光猝滅強度最大，反應溫度為43 ℃時，熒光猝滅強度最小，說明反應溫度的升高，不利于Fe3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針形成復合物，因此，Fe3O4/GO與沙門氏菌捕獲探針最佳反應溫度為37 ℃。

a-反應時間;b-反應溫度
圖3 反應時間及溫度對熒光猝滅作用的影響
Fig.3 Effect of reaction time and temperature on fluorescence quenching

2.2.3 雜交時間的優化

雜交時間決定著DNA分子之間是否完全雜交，是影響雜交反應的因素之一[20]。本實驗將1 pmol/L 沙門氏菌目標DNA與Fe3O4/GO捕獲探針復合物在42 ℃條件下進行雜交，分別考察雜交時間30、60、90、120、150 min對熒光強度的影響。實驗結果如圖4所示，在30～120 min，熒光強度隨反應時間的增加而增加，當反應時間>120 min時，熒光強度幾乎不變，空白對照組中的熒光強度隨反應時間的增加保持相對恒定，則最佳雜交時間為120 min。

圖4 雜交時間對熒光強度的影響
Fig.4 Effect of hybridization time on fluorescence intensity

2.2.4 富集倍數的優化

若待測目標物DNA含量過低，則很難對其進行檢測，為保證Fe3O4/GO能將待測目標物DNA捕獲并富集，通過對待測目標物DNA進行富集處理，可使熒光信號強度放大，進而提高檢測靈敏度[20]，故對富集倍數進行了優化。實驗測定了富集1、3、5、7和9倍5組不同富集倍數下的熒光強度。圖5為富集倍數隨熒光強度及相對熒光強度變化的折線圖。由圖5-a可知，實驗組和空白對照組的熒光強度均隨富集倍數的增加而增加，而空白對照組的熒光強度增加較緩慢，其原因可能是待測液體積隨富集倍數的增加而減少，導致背景熒光物質的濃度增加，所檢測的空白對照組中的熒光強度也隨之增加[20]。由圖5-b可知，相對熒光強度F/F0(F為實驗組熒光強度，F0為空白對照組熒光強度)隨富集倍數的增加先增大后逐漸減小，富集5倍時的相對熒光強度F/F0最大。因此，Fe3O4/GO對待測目標物DNA的最優富集倍數為5倍。

a-熒光強度隨富集倍數的變化; b-相對熒光強度隨富集倍數的變化
圖5 熒光強度及相對熒光強度隨富集倍數的變化
Fig.5 Fluorescence intensity and relative fluorescence intensity as a function of enrichment factor

2.2.5 沙門氏菌目標DNA的檢測分析

在最優實驗條件下，分別檢測了不同濃度下的沙門氏菌目標DNA的熒光強度，圖6-a為不同濃度沙門氏菌目標DNA的熒光光譜圖，熒光強度隨沙門氏菌目標DNA濃度的增加而增加；由圖6-b可知，熒光強度與沙門氏菌目標DNA濃度在0.005～1 pmol/L呈良好的線性關系，線性回歸方程y=7.065 9x+2.614 7，R2=0.998 1(x為沙門氏菌目標DNA濃度，y為相對熒光強度F/F0)，檢出下限為5 fmol/L(S/N=3)[23]。11次重復0.01 pmol/L沙門氏菌目標DNA濃度來評價該方法的精密度，其相對標準偏差為2.78%，說明所建立的檢測方法具有較高的靈敏度和精密度。

a-不同濃度目標DNA的熒光光譜圖;b-目標DNA濃度與 熒光強度的線性關系圖
圖6 不同濃度目標DNA的熒光光譜圖和目標DNA 濃度與熒光強度的線性關系圖
Fig.6 Fluorescence spectrum of target DNA at different concentrations and linear relationship between target DNA concentration and fluorescence intensity

2.3 雞肉樣品的檢測及樣本分析

2.3.1 雞肉樣品的檢測

取購自超市的新鮮雞胸肉，按照1.3.6中的方法進行預處理，以提取的沙門氏菌DNA為目標DNA，利用所建立的方法對其進行檢測，將熒光分光光度計所測的熒光強度與沙門氏菌菌落總數進行統計分析處理，結果如圖7所示，沙門氏菌菌落總數在102～106CFU/mL時，菌落總數對數與相對熒光強度具有良好的相關性，回歸方程為y=0.700 4x+1.358 4，R2= 0.999 3(x為沙門氏菌總數對數，y為相對熒光強度F/F0)，檢出限為102CFU/mL(S/N=3)[23]。

圖7 相對熒光強度與菌落總數對數的線性關系
Fig.7 Linear relationship between relative fluorescence intensity and the total number of colonies

2.3.2 雞肉樣本分析

為了考察所建立檢測方法的準確性和可靠性，分別將PBS溶液稀釋的標準菌液加入到雞肉樣本中并進行預處理，用細菌基因組DNA提取試劑盒分別提取不同雞肉樣本中沙門氏菌的DNA，在沙門氏菌目標DNA最優檢測條件下，對其進行熒光測定，將相對熒光強度F/F0帶入2.3.1中的回歸方程即可計算出其檢測值，以實際檢測沙門氏菌的數量與添加沙門氏菌數量的比值計算加標回收率。結果如表2所示，該方法在雞肉樣品中的加標回收率為96.8%～105.6%，RSD<4.52%，在不添加沙門氏菌標準菌液的雞肉樣本中未檢測到沙門氏菌。結果表明該方法檢測結果準確可靠，可用于實際雞肉樣本中沙門氏菌的檢測。

表2 雞肉樣本的回收率測定結果Table 2 Results of determination of recovery rate of chicken samples

注：-表示無

2.4 特異性檢測

為了驗證檢測方法的特異性，用DNA提取試劑盒分別提取沙門氏菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的DNA，在相同條件下，分別對其進行熒光測定，并扣除其背景吸收，結果如圖8所示，沙門氏菌DNA具有較強的熒光強度，大腸桿菌的熒光強度與金黃色葡萄球菌的熒光強度相接近，且明顯低于沙門氏菌DNA的熒光強度，結果表明所建立檢測沙門氏菌的方法特異性好且具有良好的選擇性[15]。

圖8 本方法對沙門氏菌檢測的特異型分析
Fig.8 Analysis of the specificity of this method forSalmonelladetection

2.5 本方法與其他檢測方法的比較

為了研究所建立檢測沙門氏菌方法的優越性，將該方法與文獻中其他檢測沙門氏菌的方法進行了對比，對比結果如表3所示，該檢測方法具有較低的檢出限和較短的檢測時間，檢出限決定了檢測方法的精密程度，因此，該方法能實現對沙門氏菌的快速檢測。

表3 本方法與其他文獻報道的檢測沙門氏菌方法的比較Table 3 Comparison of this method with other methods for detecting Salmonella

3 結論

本研究利用Fe3O4/GO能將帶有熒光標記的單鏈捕獲探針吸附在其表面并使其熒光猝滅，基于雜交互補反應，捕獲探針分別與先后加入體系的沙門氏菌目標DNA和釋放探針完成雜交，并從Fe3O4/GO表面釋放出來，熒光恢復，利用磁場分離Fe3O4/GO，通過檢測上清液熒光強度即可實現對沙門氏菌DNA的高靈敏檢測。所建立的熒光標記DNA-磁性氧化石墨烯磁分離技術快速檢測雞肉中沙門氏菌的方法與其他檢測方法相比，該方法具有較低的檢出限和較短的檢測時間，能夠實現沙門氏菌的快速、高靈敏度和特異性檢測，對其他致病菌的檢測具有指導意義。