甜型黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的生成規律

孔令華，夏小樂*，辛瑜*

1(工業生物技術教育部重點實驗室(江南大學)，江蘇 無錫，214122)2(江南大學 生物工程學院，江蘇 無錫，214122)

黃酒(Chinese rice wine)是以稻米、小麥等為主要原料，經浸米、蒸煮、糖化發酵、壓榨過濾、煎酒、陳釀等步驟釀造而成的中國傳統發酵酒精飲料[1]。其中甜型黃酒是指含糖量>100 g/L的黃酒，其口味鮮甜醇厚，香氣濃郁。陳釀時間是評價黃酒質量高低的重要指標[2]，新酒經過陳釀不斷發生物理和化學反應。由于黃酒中含有豐富的還原糖[3]、氨基酸[4]等物質，新酒中羰基化合物和氨基化合物在常溫條件下不斷進行美拉德反應，并產生大量美拉德反應產物，一方面增加了黃酒的色澤和風味[5-6]，另一方面很多美拉德反應產物，例如5-羥甲基糠醛(5-hydroxymethylfurfural，5-HMF)、糠醛和丙烯酰胺[7]等，具有一定的神經毒性和遺傳毒性[8-9]。

通常新鮮果汁中5-HMF不超過10 mg/L[7]，歐盟規定蜂蜜中的最大限量為40 mg/kg[8]；在酒精飲料中，例如威士忌和朗姆酒中5-HMF質量濃度達到40～50 mg/L[9]；在干李子及其飲品、咖啡粉、可可粉等食品中5-HMF質量分數較高，可超過500 mg/kg[10]。新鮮食用的食品/飲品中5-HMF主要來源于熱處理加工[11-14]，而黃酒中5-HMF是在較長的儲存過程中產生的，當黃酒中5-HMF含量過高且攝入過多會對人體健康產生不利影響。這些具有安全風險的物質在一定程度上影響了黃酒的發展。

本文研究了甜型黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的含量變化，結合甜型黃酒中主要成分的含量變化(還原糖、氨基態氮、總酸及pH值等)，并通過甜型黃酒模擬體系設置各因素(理化指標)與5-HMF形成的關系，揭示了5-羥甲基糠醛在甜型黃酒陳釀過程中的生成規律。

1 材料與方法

1.1 材料與設備

陳釀黃酒樣品，江蘇和浙江地區3個酒廠(B、G、Z)提供的陳釀甜型黃酒，樣品具體信息如表1所示。

5-羥甲基糠醛(5-HMF)標準品，梯希愛(上海)化成工業發展有限公司；DNS試劑，上海源葉生物科技有限公司；甲醇(HPLC級)、葡萄糖、氨基酸(Gly, Ala,Val, Leu, Ile, Phe, Tyr, Asp, Glu, Lys, Met, Ser, Thr,Cys, Pro, His, Arg)、無水乙醇、乳酸、NaOH、甲醛等，中國醫藥集團化學試劑有限公司。

HITACHI chromaster高效液相色譜儀，日本日立公司；Agilent分析色譜柱Eclipse Plus C18250 mm×4.6 mm(5 μm)，美國安捷倫公司；Enspire多標記檢測系統(酶標儀)，珀金埃爾默有限公司；DK-8D電熱恒溫水槽，上海精宏實驗設備有限公司；AS220.R2電子天平，波蘭RADWAG Wagi Elektroniczne公司；FE28pH計，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；SB-4200DT超聲波清洗儀，寧波新芝生物科技股份有限公司。

表1 取樣甜型黃酒基本信息Table 1 Basic information of sampling sweet Chinese rice wine

1.2 實驗方法

1.2.1 黃酒中理化指標的檢測

還原糖測定采用DNS法[15]；pH、總酸、氨基態氮的測定參照GB/T 13662—2018《黃酒》[16]。

1.2.2 5-羥甲基糠醛(5-HMF)標準溶液的配制

精確稱取0.037 29 g 5-HMF 標準品, 用5%甲醇水溶液溶解后定容至100 mL, 制得0.372 9 mg/L 的5-HMF 標準品貯備液，并用5%(體積分數)甲醇水溶液稀釋成不同濃度的標準品工作液。

1.2.3 樣品的前處理及5-羥甲基糠醛(5-HMF)檢測方法

將黃酒樣品用5%甲醇水溶液稀釋至相應濃度，使用0.45 μm纖維素濾膜過濾后進樣。

使用高效液相色譜法檢測黃酒中5-HMF[17]。將20 μL樣品注入Agilent Eclipse Plus C18分析色譜柱進行色譜分離，使用甲醇和超純水進行等度梯度洗脫(體積比5∶95)； 在30 ℃以1.0 mL/min的流速進行檢測，在284 nm記錄色譜圖來進行數據采集。樣品中的5-HMF含量通過標準曲線計算。

1.2.4 甜型黃酒模擬體系的構建

配置質量濃度為200 g/L葡萄糖溶液母液，20 g/L混合氨基酸溶液母液(17種氨基酸等比混合)，12 g/L乳酸溶液母液。因素條件(葡萄糖、氨基酸、乳酸)為分別添加該因素質量濃度不同的工作液，其余因素添加濃度條件固定，其中固定濃度條件分別為葡萄糖質量濃度100 g/L、氨基酸質量濃度3 g/L、乳酸質量濃度6 g/L，之后使用15%(體積分數)乙醇水溶液定容；因素條件(pH值)為添加上述相同固定濃度條件，使用15%(體積分數)乙醇水溶液定容，之后調節pH至相應梯度。

將所有樣品置于90 ℃、1 h水浴加熱，結束后立即冷卻至室溫。樣品按1.2.3進行5-HMF的檢測。

1.3 數據分析

每個實驗進行平行重復3次。數據表示為平均值±標準誤差。使用Orgin 2016、Adobe Illustrator和 SPSS 19.0軟件進行數據統計、方差分析和作圖。Pearson檢驗用于確定平均值之間差異的顯著性，P>0.05表示無顯著性差異，0.01

2 結果與分析

2.1 黃酒中5-羥甲基糠醛的含量

2.1.1 5-羥甲基糠醛檢測的標準曲線

取5-羥甲基糠醛標準品貯備液，用5%(體積分數)甲醇水溶液稀釋成質量濃度不同的標準品工作液，在上述色譜條件下進樣，以5-羥甲基糠醛的峰面積與其質量濃度進行線性回歸，得到回歸方程y=483 793x+9 107.6，R2=0.999 3。實驗結果表明，其質量濃度與峰面積之間存在良好的線性關系。

2.1.2 黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的含量

從甜型黃酒在陳釀過程中5-羥甲基糠醛(5-HMF)的含量變化(圖1)來看，在常溫條件下，隨時間增加美拉德反應不斷進行，甜型黃酒中5-HMF含量從初始較低到呈指數增加，且后期增長趨勢變緩。從地域上看，其中酒廠G(浙江地區)中5-HMF的整體含量較高，其5-HMF的質量濃度在新酒中為15.35 mg/L，8年陳釀后達到565.40 mg/L，可能和其傳統型發酵工藝積累較多還原糖和氨基態氮以及酒體酸度相對較高有關。而酒廠B、Z(江蘇地區)8年陳釀后5-HMF質量濃度分別達到516.56和401.70 mg/L，可能和江蘇地區黃酒大多為清爽型工藝，黃酒中糖分、氨基態氮含量及總酸含量都較低有關。

圖1 甜型黃酒陳釀過程中5-羥甲基糠醛的質量濃度
Fig.1 Content of 5-hydroxymethylfurfural during the aging process of sweet Chinese rice wine

2.2 甜型黃酒中理化指標的含量

2.2.1 甜型黃酒中還原糖及氨基態氮含量

5-HMF的生成途徑主要有2條，一條為還原糖和氨基酸之間的美拉德反應[12]，另一條為還原糖高溫條件下直接裂解[18]，例如果糖可以在強酸性干燥條件下脫水得到。而在黃酒中5-HMF主要來源于美拉德反應，即醛糖和氨基化合物經反應生成N-糖基胺，之后經過Amadori重排生成重排產物，在酸性條件下(pH≤7)生成5-HMF。

由圖2可知，在甜型黃酒陳釀過程中還原糖含量和氨基態氮含量都在不斷提高，還原糖含量增加一方面主要是由于在黃酒酸性作用下淀粉糊化后逐漸轉化成葡萄糖，另一方面在長時間儲存過程中液體的蒸發致使還原糖的濃度有所增加；而黃酒中氨基態氮的不斷升高是由于在黃酒陳釀過程中蛋白質會逐漸被分解為多肽和氨基酸。由此印證了2.1中酒廠G甜型黃酒中5-HMF的含量相對較高是由于其還原糖和氨基態氮含量相對較高。

所以甜型黃酒中5-HMF含量的逐年增加，一方面是由于隨時間增加美拉德反應不斷進行，另一方面是由于還原糖和氨基態氮不斷提高從而為5-HMF提供底物。

a-還原糖質量濃度;b-氨基態氮質量濃度
圖2 甜型黃酒陳釀過程中還原糖及氨基態氮質量濃度的變化
Fig.2 Changes of reducing sugar and amino nitrogen content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.2.2 甜型黃酒中pH、總酸含量

5-HMF是美拉德反應在酸性條件下形成，由于陳釀過程中黃酒中醇酸類不斷酯化以及少量有機酸的揮發，如圖3所示，在甜型黃酒陳釀過程中黃酒的總酸含量都降低了0.3～1 g/L，相應的pH值略微升高了0.05～0.2，雖然pH值在3.5～4.0仍促進5-HMF的生成，這可能是甜型黃酒在1年陳釀后5-HMF增長速度減慢的一個原因。

a-pH值;b-總酸質量濃度
圖3 甜型黃酒陳釀過程中pH值、總酸質量濃度的變化
Fig.3 Changes of pH,total acid content during the aging of sweet Chinese rice wine

2.3 甜型黃酒中5-羥甲基糠醛的含量與理化指標的相關性分析

在探究了3個酒廠甜型黃酒中5-HMF含量及其黃酒中主要成分的含量變化后，可以看出3個酒廠之間只存在含量差異但變化規律相似，故將3個酒廠的5-HMF含量及理化指標含量平均值作相關性分析，如圖4所示，5-HMF與所有理化指標都呈顯著相關，其中5-HMF與還原糖含量和氨基態氮含量在0.05水平(雙側)上顯著相關，而5-HMF 與pH和總酸含量在0.01水平(雙側)上顯著相關，證明在甜型黃酒中還原糖和氨基態氮作為反應底物，低pH值與酸性條件作為反應條件都是影響5-HMF含量的重要因素。

圖4 甜型黃酒中5-HMF的含量與理化指標含量的 相關性
Fig.4 Correlation between 5-HMF and physicochemical parameters in sweet Chinese rice wine
注：**表示在0.01水平(雙側)上顯著相關；*表示在 0.05 水平 (雙側)上顯著相關

2.4 甜型黃酒模擬體系中5-羥甲基糠醛的含量與各影響因素的關系

2.4.1 葡萄糖含量及氨基酸含量與5-HMF生成的關系

在甜型黃酒中總糖一般以葡萄糖含量計[14]，使用葡萄糖作為甜型黃酒模擬體系的還原糖進行實驗。以葡萄糖的濃度與5-HMF含量進行線性回歸，得到回歸方程為y=3.737 6x-37.618，R2=0.994 4，如圖5-a所示，葡萄糖含量和5-HMF生成呈良好的線性相關。也就是說黃酒的甜度越高時，其5-HMF的含量越多。另外當葡萄糖不存在時，此時模擬體系中不生成5-HMF，進一步證實還原糖(葡萄糖)是甜型黃酒中生成5-HMF的必要因素。

氨基態氮指的是以氨基酸形式存在的氮元素的含量，使用游離氨基酸含量表示氨基態氮含量。由圖5-b可知在模擬體系中少量添加氨基酸后，隨著氨基酸濃度的增加5-HMF的含量也隨之增加，這時由于氨基酸含量的不斷增加和葡萄糖反應生成5-HMF。當添加氨基酸質量濃度超過8 g/L，5-HMF的含量明顯下降，此時體系中過量氨基酸又和5-HMF繼續美拉德反應從而降低了其含量，也就是說氨基酸不是甜型黃酒中生成5-HMF的必要因素，但甜型黃酒中存在的氨基態氮的含量(2.2.1)影響著其5-HMF的含量，可以和還原糖不斷反應生成5-HMF。

a-葡萄糖;b-氨基酸
圖5 甜型黃酒模擬體系中5-HMF質量濃度與 葡萄糖濃度和氨基酸質量濃度的變化
Fig.5 Changes of 5-HMF, glucose and amino acid concentration in sweet Chinese rice wine simulation

2.4.2 pH值、總酸含量與5-HMF生成的關系

如圖6-a所示，在美拉德反應的甜型黃酒模擬體系中，當pH≤7時會生成5-HMF，尤其是當pH<3時含5-HMF會劇烈生成，在pH=1時體系產生的5-HMF量達到了1 393 μg/L，是pH=7時體系中5-HMF含量的116倍。由2.2.2得到甜型黃酒中的pH在3～4，此時的甜型黃酒也是促進5-HMF生成的體系。而當pH>7時不生成5-HMF，此時醛糖和氨基化合物反應生成的Amadori重排物在堿性條件下生成醇醛類物質等其他美拉德反應產物。

在黃酒中總酸含量一般以乳酸含量計[14]。隨著乳酸含量的增加，模擬體系中5-HMF含量隨之逐漸增加，如圖6-b所示，當外加乳酸的含量為0 g/L時，此時體系仍然有5-HMF的生成，可能因為此時體系pH值依然為酸性(pH<6)，如圖6-c所示。當乳酸含量不斷增加時，體系的pH值也在不斷降低，從而不斷促進體系中5-HMF的生成。所以總酸含量對5-HMF積累的作用是通過改變體系pH值來影響5-HMF的含量。

綜上所述，在甜型黃酒體系中pH值是影響5-HMF生成的必要因素，尤其在極低pH值時非常有利于5-HMF的生成。

a-pH值；b-乳酸；c-不同乳酸質量濃度下pH值
圖6 甜型黃酒模擬體系中5-HMF質量濃度與pH值和總酸質量濃度的變化以及不同總酸質量濃度下的pH值
Fig.6 Changes of 5-HMF,pH value and lactic acid content in sweet Chinese rice wine simulation system and pH value under different lactic acid content

3 結論

其他新鮮食品中5-HMF主要來源于熱處理過程，在甜型黃酒生產工藝中煎酒時間較短且溫度相對熱處理食品較低，甚至有些甜型黃酒由于含糖量高且酒精度高不需要煎酒殺菌處理，所以其5-HMF含量主要是常溫長時間儲存產生的。在甜型黃酒陳釀過程中，5-HMF含量隨著陳釀時間增加而逐年增加，同時黃酒中還原糖和氨基態氮的含量也在緩慢增加，并由甜型黃酒模擬體系實驗證實還原糖對于5-HMF生成的必要作用和氨基酸的存在對5-HMF生成的影響作用，即在甜型黃酒陳釀過程中可以為5-HMF的生成源源不斷提供底物。5-HMF是美拉德反應在酸性條件下形成的，由模擬體系實驗得到5-HMF在pH值越低時越容易生成，而在甜型黃酒陳釀過程中總酸含量略減少，相應pH值在升高，可能是在甜型黃酒陳釀后期5-HMF含量的增長速度減慢的原因。

綜上所述，甜型黃酒中還原糖、氨基態氮含量、總酸含量及pH值是影響甜型黃酒中5-HMF生成的因素，其中必需的因素是還原糖和酸性條件。在甜型黃酒中較高的葡萄糖含量和黃酒本身酸性體系是5-HMF含量較高的主要原因，加之長時間的儲存更使甜型黃酒中5-HMF不斷積累。當5-HMF攝入量過高時，會對人體健康有風險，所以一方面需要消費者控制自身飲用量，另一方面可以采取一些調控措施[17,19-20]來適當控制其含量。