專一性酶解-高效液相色譜-熒光檢測法測定3種食用油中4種多環芳烴

章再婷，楊 燕，王永健，王春芳?，李 雙，陳樹兵，曹國洲

(1.寧波中盛產品檢測有限公司，寧波 315012；2.寧波海關技術中心，寧波 315012)

多環芳烴(PAHs)作為一類強致癌性化合物，主要來源于反復使用或高溫油炸的非正常食用油中[1-2]。苯并[a]蒽(Ba A)、苯并[b]熒蒽(BbF)、苯并[k]熒蒽(Bk F)和苯并[a]芘(BaP)是毒性較強的4種PAHs，其中BaP被國際癌癥研究機構歸為1類致癌物，其余3種被歸為2B 類致癌物[3-5]。受暴利的驅使，非正常食用油越來越頻繁的出現在人們的生活中，對人們的身體健康造成巨大的威脅，是國家嚴厲打擊的食品違法行為的對象。因此，建立能夠快速同時測定食用油中這4 種PAHs含量的方法尤為重要。

目前建立的食用油中單一或多個PAHs的快速篩查方法主要涉及兩方面內容:前處理方法和儀器分析方法。儀器分析方法包括液相色譜-熒光檢測法(LC-FLD)、氣相色譜-氫火焰離子化檢測法(GC-FID)、氣相色譜-質譜法(GC-MS)和液相色譜-質譜法(LC-MS)等[6-13]。其中，GC-MS 和LC-MS對前處理凈化條件要求比較嚴格，油脂的離子化抑制效應明顯，其回收率及穩定性均劣于LC-FLD 和GC-FID 的。由于4 種上述PAHs均具有多環結構，LC-FLD 的專一性更強，其對加工處理的或按照比例滲入的食用油的檢出限均能達到ng·kg－1級，更適用于食用油中微量化合物的鑒別分析。前處理方法主要包括基質分散萃取法(Qu ECh ERS等)，固相萃取法(HLB小柱、中性氧化鋁柱等)和凝膠滲透色譜法(GPC)等[6-13]。其中固相萃取法中是通過氫鍵作用將待測物保留在吸附劑上，其雖能有效除去油脂基質，但操作過程繁瑣耗時、重現性差。文獻[8]建立了地溝油中BaP含量檢測的Oasis HLB小柱凈化方法，但該方法對于含有多個環狀結構的親脂性待測物的回收率不高；GPC雖具備自動化優勢，但單樣凈化耗時較長(3 h)，且消耗有機溶劑較多，試驗成本高。油脂中親脂性待測物的快速、高效提取，是食用油中PAHs含量檢測面臨的一個艱巨挑戰。

目前，脂肪酶酶解技術主要應用于營養成分分析，如脂肪酸及各種維生素的檢測，在食品添加劑及有毒有害物質檢測方面應用甚少。本工作根據這4種PAHs的多環結構和食用油基質中高脂肪含量的特點，前處理采用專一性酶解法處理樣品，采用高效液相色譜-熒光檢測法(HPLC-FLD)對樣品提取液中Ba A、Bb F、Bk F 和BaF 等4種PAHs的含量進行了測定，以期為提高政府監管部門的監管工作效率，保證食品安全提供了基礎。

1 試驗部分

1.1 儀器與試劑

LC-20AT 型高效液相色譜儀，配熒光檢測器；Milli-Q 型高純水發生器；SF-40R 型冷凍離心機；TKA 型漩渦振動器；Hei-VAP Expert型旋轉蒸發儀；DK-S28型電熱恒溫水浴鍋；0.22μm 尼龍濾膜。

單標準儲備溶液:取0.01 g單標準品，用二氯甲烷溶解，轉移至10 mL 的容量瓶中，用乙腈稀釋至刻度，得到1.0 g·L－1的單標準儲備溶液，于－20 ℃下保存。

磷酸鹽緩沖溶液:0.108 g·mL－1，稱取54 g的磷酸二氫鉀，用500 mL 水溶解，氫氧化鉀調至p H為8.0。

混合標準溶液:稱取4種PAHs的單標準儲備溶液各10μL，用乙腈定容至10.0 mL，配制成1.0 mg·L－1標準溶液，于－20 ℃避光保存。

混合標準溶液系列:稱取適量混合標準溶液，用乙腈稀釋至刻度，配制0，0.1，0.5，1.0，2.0，5.0μg·L－1的混合標準溶液系列。

Ba A、Bb F、Bk F 和BaF 的純度不小于95%；脂肪酶的酶活性大于700 U·mg－1。

正己烷、乙腈、二氯甲烷、乙醇均為色譜純；其他試劑為分析純；試驗用水為超純水(電阻率18.2ΩM·cm)。

動物油、植物油和煎炸油等3種常見食用油來自國家殘留監控抽樣和進出口送檢企業。

1.2 儀器工作條件

Dikma Plus C18色譜柱(250 mm×4.6 mm，5.0μm)，柱溫40 ℃；流動相:A 為水，B 為乙腈；流量1.0 mL·min－1；進樣量20μL；梯度洗脫程序見表1。0～10 min時，Ba A 的熒光激發波長(λex)為270 nm，發射波長(λem)為380 nm；10～20 min時，Bb F、Bk F和BaP的λex為294 nm，λem為406 nm。

表1 梯度洗脫程序Tab.1 Program of gradient elution

1.3 試驗方法

稱取2.0 g樣品，依次加入5 mL磷酸鹽緩沖溶液(pH 8.0)和0.2 g脂肪酶，恒溫(37±2)℃振蕩酶解2 h。加入1.0 g碳酸鉀，5 mL 乙醇，渦旋混勻。在提取溶液中加入15 mL 正己烷，5 mL 水，振蕩5 min，以4 500 r·min－1轉速離心5 min，取下層水相按上述步驟重復萃取一次。合并萃取液，于40 ℃旋蒸至干，用1.0 mL乙腈復溶，過0.22μm 濾膜，濾液按照儀器工作條件進行測定。

2 結果與討論

2.1 色譜行為

按照儀器工作條件，對5.0μg·L－1混合標準溶液進行測定，色譜圖見圖1。Ba A、BbF、Bk F和BaP的保留時間分別為9.3，12.0，12.6，13.9 min。

圖1 4種PAHs混合標準溶液的色譜圖Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution of the 4 PAHs

2.2 脂肪酶、酶解時間及碳酸鉀用量的選擇

針對食用油特殊基質成分和4 種PAHs的弱極性性質，試驗采用專一性脂肪酶處理樣品，緩沖溶液選擇磷酸二氫鉀緩沖溶液(pH 8.0)，整個酶解過程溫度控制在(37±2)℃，此條件可以在保證酶活性的同時，又可以降低基質中脂肪的干擾。皂化反應經常用來去除油脂，其通常在濃堿環境下進行(氫氧化鉀或氫氧化鈉等強堿性化合物)，但在此環境中，待測化合物的結構極易被破壞，且有機相中殘留的強堿性化合物需多次水洗才可以消除，不可避免的造成待測化合物的損失、檢測時間的加長和檢測成本的增加。因此，本工作采用碳酸鉀進行皂化反應，碳酸鉀不僅可以提供弱堿性環境和終止酶解反應，還可以皂化油脂，確保最大的除油率，除油率(X)可通過測量氮吹充分后殘余油脂的精確質量值計算:

式中:m X是指經脂肪酶水解和碳酸鉀皂化除油后的殘余油脂質量，g；m0是指未經任何處理的殘余油脂質量，g；X，%。

脂肪酶用量以及酶解時間都與除油率相關聯。試驗考察了脂肪酶用量分別為0.05，0.1，0.2，0.5，1.0 g，酶解時間分別為1.0，2.0，3.0，5.0 h時對動物油、植物油和經用于煎炸的食用油(煎炸油)等3種常見食用油除油率的影響。

圖2 脂肪酶用量、酶解時間對3種食用油除油率的影響Fig.2 Effect of the amount of lipase and time of enzymolysis on the rate of oil-removal of the 3 edible oils

由圖2可知:當脂肪酶用量為0.05 g和0.1 g時，除油率受酶解時間影響較大，此時，酶解時間大于等于2.0 h的除油率較1.0 h的明顯增加，但均低于80%；當脂肪酶用量大于0.1 g 時，酶解時間2.0 h的除油率明顯高于1.0 h的，但2.0，3.0，5.0 h的除油率差別很小。從節約時間和成本的角度出發，試驗選擇脂肪酶用量為0.2 g，酶解時間為2.0 h。

試驗還考察了碳酸鉀用量分別為0，0.5，1.0，2.0 g時對除油率的影響。

圖3 碳酸鉀用量對3種食用油除油率的影響Fig.3 Effect of the amount of K2 CO3 added on the rate of oil-removal of the 3 edible oil samples

由圖3可知:當碳酸鉀的用量不大于1.0 g時，除油率隨著碳酸鉀用量的增加而增加；當碳酸鉀用量為1.0 g 時，除油率達到最大區間(98.1%～99.8%)；碳酸鉀用量為2.0 g時，除油率反而降低，推測可能是由于過量的碳酸鉀造成了過堿環境，破壞了酶的活性進而降低了除油效率。因此，試驗選擇碳酸鉀的用量為1.0 g。

2.3 乙醇和正己烷用量的選擇

萃取前，在待皂化的樣品溶液中加入適量乙醇可以有效防止乳化現象的發生，此外，乙醇還能起到預萃取的作用。同時，4種PAHs屬于弱極性化合物，萃取劑正己烷的用量對其回收率的影響較大。因此，試驗考察了乙醇用量分別為2.5，5，10，15 mL，正己烷用量分別為15，30，45 mL時對混合標準溶液的添加量為0.1μg·kg－1的動物油、植物油和煎炸油等3類常見食用油中4種PAHs回收率的影響，試驗發現乙醇用量為2.5 mL時，體系乳化現象仍嚴重，無法計算回收率，其余結果見表2～表5。

表2 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BaA回收試驗結果Tab.2 Results of test for recovery of BaA in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

表3 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BbF回收試驗結果Tab.3 Results of test for recovery of BbF in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

表4 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BkF回收試驗結果Tab.4 Results of test for recovery of Bk F in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

由表2～表5結果可知:正己烷用量為15 mL時，4種PAHs的回收率較低，均低于77%；當正己烷用量為30 mL和45 mL 時，回收率趨于穩定，均能達到90%以上。當乙醇用量不小于5 mL 時，4種PAHs回收率相差不大，而乙醇用量為5 mL時即可保持液-液界面清晰消除乳化現象。從節約濃縮時間和成本的角度出發，試驗選擇的乙醇用量為5 mL，正己烷用量為30 mL。

表5 不同乙醇和正己烷用量下3種常見食用油中BaP回收試驗結果Tab.5 Results of test for recovery of BaP in the 3 edible oils with different amounts of ethanol and n-hexane

2.4 流動相及色譜柱的選擇

采用液相色譜檢測目標化合物時，經常在流動相中加入緩沖鹽以增加儀器的響應靈敏度，但緩沖鹽的大量長期使用會對儀器造成損害。試驗考察了分別以甲醇-水和乙腈-水體系作流動相時對4 種PAHs的色譜行為的影響。結果表明:乙腈-水體系柱壓更低、安全性好，所以，試驗選擇乙腈-水體系為流動相，通過對其梯度洗脫條件的優化，得到了合適的保留時間、峰形及分離效果。另外，試驗還對Dikma Plus C18色譜柱和Hypersile Gold C18色譜柱的分離效果進行了考察，結果顯示，2種色譜柱僅表現出組分保留時間的差異，分離度均可滿足檢測需要，考慮到經濟成本，試驗選擇了Dikma Plus C18色譜柱。

2.5 標準曲線、檢出限和測定下限

按照試驗方法對混合標準溶液系列進行測定，以保留時間定性、外標法定量。以4種PAHs的質量濃度為橫坐標，其對應的儀器響應值(響應值＝標準物質的峰面積/標準物質的質量濃度為縱坐標繪制工作曲線。4 種PAHs標準曲線的線性范圍為0.1～5.0μg·L－1，線性回歸方程、相關系數見表6。

以3倍信噪比和10倍信噪比計算檢出限(3S/N)和測定下限(10S/N)，結果見表6。

2.6 精密度和回收試驗

在3種常見食用油中進行3個濃度水平的加標回收試驗，計算回收率和測定值的相對標準偏差(RSD)，結果見表7。

表6 線性參數、檢出限和測定下限Tab.6 Linearity parameters，detection limits and lower limits of determination

表7 精密度和回收試驗結果(n＝5)Tab.7 Results of tests for precision and recovery(n＝5)

由表7可知:4種PAHs的回收率為90.4%～99.9%，RSD 均在10%以內，說明本方法對這3種食用油均具有較強的適用性，可實現油脂中4 種PAHs的快速提取、凈化的目的。

本工作根據4種PAHs的多環結構以及食用油基質中高脂肪含量的特點，建立了專一性酶解-高效液相色譜-熒光檢測法測定3 種食用油中4 種PAHs含量的方法，該方法大大降低了前處理時間和油脂的基質抑制效應，檢出限遠低于現有方法[6-11]，為各類食用油中這4種PAHs的檢測開辟了新的途徑，可作為油脂中親脂性化合物的快速檢測技術廣泛推廣。