常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達及其與血管生成和細胞增殖活性的相關性研究

邢其棋，張 芳，劉 棟，劉夫玲

0引言

腫瘤發生侵襲轉移是一個多環節、多步驟的動態過程，涉及腫瘤細胞的黏附、降解、移動和血管生成、增殖等事件。類表皮生長因子結構域7(epidermal growth factor like domain7，EGFL7)的研究涉及血管形成過程中的關鍵性作用。本文擬檢測常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達，及其與微血管密度(microvascular density，MVD)、腫瘤細胞增殖活性(Ki67)的相關性。為腫瘤的預后判定及抗血管生成治療提供新的探索。

1材料和方法

1.1材料收集2009-01/2019-01青島市市立醫院住院手術患者10例正常淚腺組織(正常淚腺組織取自因炎性假瘤、Mikulicz病等良性淚腺腫瘤切除后，標本中的部分正常淚腺組織)和46例淚腺上皮性腫瘤患者，術后病理分別為淚腺多形性腺瘤20例、多形性腺癌12例、腺樣囊性癌14例。主要試劑：兔抗EGFL7單克隆抗體(北京博奧森生物技術有限公司)，鼠抗CD34單克隆抗體、鼠抗Ki67單克隆抗體(中杉金橋生物技術有限公司)。本研究經我院倫理委員會審批通過,所有患者均知情同意。

1.2方法采用鏈霉菌抗生物素蛋白-過氧化物酶連結法(streptavidin-peroxidase，SP)，行高溫高壓修復抗原處理，染色步驟按SP試劑盒提供的說明書進行。用磷酸鹽緩沖鹽液(PBS)替代一抗作陰性對照，用已知陽性切片作陽性對照。

評定標準：EGFL7染色判定標準參照 Shimizu等[1]曾描述的方法進行評定和積分。由兩位高年資病理科醫師獨立完成高倍鏡下觀察每張切片單個視野內染色陽性細胞及比例計數。根據陽性細胞占同類細胞總數的百分率及細胞染色強度綜合判定。具體為：(1)染色強度評分標準：細胞漿不顯色，0分；胞漿呈淡黃色，1分；胞漿呈棕黃色，2分；胞漿呈棕褐色，3分。(2)陽性細胞所占比例評分標準：陽性細胞數≤10%，記為0分；10%～<40%，記為1分；40%～<70%，記為2分；≥70%，記為3分。(3)染色強度評分+陽性細胞所占比例評分=總評分；總積分0～1分為陰性，大于2分為陽性；<2分為(-)，2～3分(+)，4～5分(++)，>5分(+++)。Ki67是以細胞核染成均一的棕褐色，胞漿及胞膜不著色為陽性細胞。隨機選取5個高倍鏡視野，每個視野計算100個腫瘤細胞的陽性細胞數，取其均值為Ki67指數(Ki67LI)。微血管密度(MVD)的測定參照Weidner建議的方法[2]：CD34陽性染色以血管內皮細胞胞質及胞膜出現棕黃色顆粒沉著為陽性，計數微血管染色(CD34)呈棕黃色的單個或成簇細胞群，計數時需要排除管腔直徑大于8個紅細胞的或管壁肌層較厚的微血管。計數時先用低倍鏡找出3個微血管最密集的區域，然后再用200倍鏡在上述3個視野中分別計數微血管數，最后取其平均值即為該腫瘤組織的微血管密度值。

2結果

2.1 EGFL7在正常淚腺及常見淚腺上皮性腫瘤中的表達情況EGFL7的陽性表達為細胞質呈棕黃色或棕褐色著色(圖1)，主要表達在淚腺多形性腺癌與腺樣囊性癌的腫瘤細胞中，EGFL7在12例多形性腺癌中的陽性表達率為83%(10/12)，其中弱陽性率為17%(2/12)，中等陽性率為42%(5/12)，強陽性率為25%(3/12)(表1)，在14例腺樣囊性癌中的陽性表達率為86%(12/14)，其中弱陽性率為21%(3/14)，中等陽性率為36%(5/14)，強陽性率為29%(4/14)。而在多形性腺瘤及正常淚腺組織中幾乎無陽性表達。采用Fisher確切概率法檢驗統計分析，結果顯示EGFL7在腺樣囊性癌及多形性腺癌中的表達明顯高于多形性腺瘤及正常淚腺組織中的表達，且具有統計學意義(P<0.001)，而在正常組織與多形性腺瘤中的表達無明顯統計學意義(P=1.000)，同樣在腺樣囊性癌與多形性腺癌中的表達無明顯統計學意義(P=1.000)，見表1。

2.2 MVD在常見淚腺上皮性腫瘤中的表達情況CD34相關抗原染色后，可以看到在切片組織中的腫瘤微血管染色呈棕黃色的單個或成簇細胞群(圖2)。腺樣囊性癌組織中的微血管密度為(43.43±4.60)、多形性腺癌(32.58±14.46)，顯著高于多形性腺瘤(4.20±1.19)。采用方差分析結果顯示，在常見淚腺上皮性腫瘤中MVD的表達差異具有統計學意義(P<0.001)。組間兩兩比較的結果顯示MVD在腺樣囊性癌及多形性腺癌中的表達明顯高于多形性腺瘤，且差異有統計學意義(P<0.001)，而在腺樣囊性癌與多形性腺癌之間無明顯統計學差異(P=0.822)。

圖1EGFL7在多形性腺癌和腺樣囊性癌中的表達情況A: EGFL7在多形性腺癌中的表達(+)(10×10, IHC); B:EGFL7在多形性腺癌中的表達(+)(10×40, IHC); C:EGFL7在腺樣囊性癌中的表達(+)(10×10, IHC); D: EGFL7在腺樣囊性癌中表達(+)(10×40, IHC)。

圖2CD34在腺樣囊性癌和多形性腺癌中的表達A:CD34在腺樣囊性癌中的表達(10×20, IHC); B:CD34在多形性腺癌中的表達(10×20, IHC)。

圖3Ki67在腺樣囊性癌和多形性腺癌中的表達A:Ki67在腺樣囊性癌中的表達(10×10, IHC); B:Ki67在多形性腺癌中的表達(10×10, IHC)。

表1 常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺中EGFL7蛋白的表達例

2.3 Ki67在常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺中的表達Ki67相關抗原染色后，我們可以觀察到，該抗原在所有分組中均有不同程度的表達，陽性細胞表現為細胞核呈棕褐色(圖3)。采用Ki67指數(Ki67LI)表示Ki67在組織中的表達情況。在淚腺多形性腺癌中的Ki67表達量最高為(44.83±13.68)，其次是腺樣囊性癌(26.29±8.44)，在淚腺多形性腺瘤(2.80±3.14)及正常淚腺組織(0.40±0.70)中亦有少量表達。采用方差分析結果顯示，在常見淚腺上皮性腫瘤及正常淚腺組織中Ki67的表達差異具有統計學意義(P<0.001)。且組間兩兩比較均具有明顯的統計學差異(P<0.001)。

2.4常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達水平與MVD及Ki67的關系經Spearman等級相關分析發現，在常見淚腺上皮性腫瘤中EGFL7的表達水平與MVD的表達呈明顯正相關(rs=0.897，P<0.001)，與Ki67的表達呈明顯正相關(rs=0.837，P<0.001)，見表2。

等級例數CD34Ki67LI-236.19±8.005.81±6.16+631.33±8.1425.67±5.51EGFL7++1037.70±11.4537.80±2.39+++745.71±14.2848.00±5.03

3討論

EGFL7屬于一個小基因家族，是由Fitch等[3]和Nichol等[4]首次發現，EGFL7高表達與胚胎發育早期，并證實了其在胚胎過程中主要介導引起內皮細胞運動并遷移到正確的位置形成血管管腔，缺乏EGFL7的表達可導致胚胎血管管腔形成障礙[5]。EGFL7被血管內皮細胞分泌后停留在其附近，表明其可能跟細胞外基質相關，介導細胞間相互作用[6-8]。目前研究發現EGFL7在多種人類惡性腫瘤中均有表達[9-10]，包括肺癌、膠質瘤[11]、結直腸癌、肝癌[10]、胃癌[12]、乳腺癌、前列腺癌、食道癌、卵巢癌[13]和腎癌[14]。EGFL7在各種腫瘤中的表達升高已被證明它在腫瘤的新生血管生成、腫瘤增殖及侵襲中發揮核心作用[15]。此外，近年來的研究表明，EGFL7還具有促進腫瘤細胞遷徙、上皮間質轉化[16]、免疫逃逸[17]等作用。

血管生成在病理條件下，這一過程將導致疾病的進展與增殖，例如，腫瘤的持續快速生長需要血管生成平衡向原血管生成因子傾斜，以保證腫瘤有足夠的營養供應[18]。腫瘤增殖生長與有絲分裂活性有關[19]，許多來自細胞核細胞周期分析的報告顯示，Ki67存在于細胞周期的G1、S和G2階段，這暗示了它在許多腫瘤中作為細胞增殖標志物的作用[20]。

在此前，有研究發現[20]，在腦膠質瘤中發現Ki67與MVD呈顯著正相關，且與腫瘤分級呈正相關，說明該研究支持增殖活性依賴于血管生成水平。EGFL7的表達也與Ki67呈正相關[21]，且提示EGFL7的上調與腫瘤的增殖和侵襲密切相關。Xu等[22]研究發現，在靶向抑制了EGFL7的表達以后腫瘤的生長速度變慢，增殖活性降低，這進一步說明EGFL7的表達與腫瘤的增殖活性有密切關系。

在本實驗研究中，應用免疫組化技術檢測了EGFL7在常見淚腺上皮性腫瘤組織中的表達水平。發現EGFL7在正常淚腺組織和多形性腺瘤中幾乎沒有表達，而在多形性腺癌及腺樣囊性癌中顯著表達。使用CD34抗體標記常見淚腺上皮性腫瘤中的微血管，結果顯示，在腺樣囊性癌及多形性腺癌組織中的MVD顯著高于多形性腺瘤，并且淚腺多形性腺瘤、腺樣囊性癌及多形性腺癌中EGFL7的表達與MVD之間有明顯的正相關性，提示EGFL7可能在淚腺上皮性腫瘤的血管生成中起作用。Torben等[23]在基因工程小鼠、免疫缺陷裸鼠模型體內研究中發現相對于單獨應用抗 VEGF 藥物，聯合抗 EGFL7、抗VEGF 能明顯減緩腫瘤生長。有研究中發現EGFL7 對轉移性直腸癌患者一線化療聯合貝伐單抗有預測價值。因此，EGFL7可能成為惡性淚腺上皮性腫瘤臨床進展的一個新的預測因子。

此外，在多形性腺癌及腺樣囊性癌組織標本中Ki67的表達明顯高于多形性腺瘤及正常淚腺組織，說明在惡性淚腺上皮性腫瘤中的增殖活性明顯高于正常淚腺組織及多形性腺瘤。了解EGFL7在淚腺上皮性腫瘤的良惡性腫瘤的進展過程中的表達，這有利于抗血管生成治療在淚腺上皮性腫瘤中的應用。

通過對EGFL7在淚腺上皮性腫瘤中表達的研究，我們發現EGFL7在淚腺上皮性腫瘤中不僅可以促進腫瘤新生血管的生成，而且一定程度上促進腫瘤的增殖，通過不同的環節、不同方式對腫瘤的生物學行為產生影響，從而促進淚腺上皮性腫瘤發生、發展。通過該實驗研究表明，EGFL7可能成為評估淚腺上皮性腫瘤預后的分子標記物，并有可能成為淚腺上皮性腫瘤抗血管治療的一個潛在靶點。