檸檬苦素類化合物抗病原體作用及機制研究進展

張群琳，何雅靜，李 甜，孫志高,2*

1西南大學柑桔研究所；2中國農業科學院柑桔研究所，重慶 400712

檸檬苦素類化合物是一類主要存在于蕓香科(Rutaceae)和楝科(Meliaceae)植物中[1]的三萜類次生代謝產物，其中，在蕓香科植物(如檸檬、甜橙、葡萄柚、佛手柑)的種子、果實和果皮組織中含量豐富，并與柑橘品種有關[2]；楝科植物中的印度楝樹含檸檬苦素類化合物種類最多[3]。目前已經從蕓香科和楝科植物中分別發現了130余種該類化合物[4-6]。國內外學者對檸檬苦素類化合物的生理活性進行大量研究，發現檸檬苦素類化合物具有抗癌[7,8]、抗菌、抗病毒[9]、抗氧化和殺蟲[10,11]等生理活性。檸檬苦素配糖體大多溶于水溶液，具有預防骨質疏松[12,13]和抗肥胖[14,15]作用，且在pH2～8范圍內穩定、無味，因此被廣泛應用于傳統藥物[16,17]或作為膳食補充劑應用于現代營養制品[18]中。

近年來由于抗生素的不當使用，逐漸產生了耐藥菌株，抗菌藥物的療效和安全性呈現降低的趨勢，利用檸檬苦素類化合物的抗菌活性，將其作為一種天然的抗病原體物質具有很好的應用潛能和研究價值。本文就檸檬苦素類化合物結構、其對病原體的影響及作用機理和檸檬苦素類物質的吸收代謝情況等進行綜述，旨在為檸檬苦素類化合物于食品、醫藥領域的開發應用提供一定的理論參考。

1 檸檬苦素類化合物的結構特性

檸檬苦素類化合物是高度氧化的三萜類化合物，其特征在于含有呋喃環的四環三萜類骨架。按化學骨架和環開裂情況，主要分為四環均完整型(intact apo-euphol skeleton limonoid)、A-環開環(A-ring seco limonoid)、B-環開環(B-ring seco limonoid)、C-環開環(C-ring seco limonoid)、A，D-環開環型(A,D-ring seco limonoid)等[5]，詳見圖1。

圖1 各組檸檬苦素類化合物骨架圖

蕓香科植物中檸檬苦素類化合物主要以游離苷元和相應的β-D-葡萄糖苷形式存在，前者主要在種子中形成，后者在果實成熟過程中形成。檸檬苦素苷元類化合物(1～10)的主要的官能團為雙內酯[20]，包括檸檬苦素(limonin，1)、諾米林(nomilin，2)、黃柏酮(obacunone，3)、脫乙酰諾米林(deacetylnomilin，4)、limonexic acid(5)、isolimonexic acid(6)、枸櫞苦素(citrusin，7)、宜昌橙苦素(ichangin，8)、異黃柏酮酸(isoobacunoic acid，9)、脫氧檸檬苦素(deoxylimonin，10)詳見圖2和表1。

圖2 檸檬苦素類化合物1～15骨架圖

表1 檸檬苦素苷元類化合物主要結構特征匯總

葡萄糖苷類檸檬苦素類化合物(11～15)是由檸檬苦素苷元在17位和1分子葡萄糖以糖苷鍵的形式結合而形成的，主要官能團為內酯、二羧酸[20]，主要包括檸檬苦素17-R-D-glucoside(11)、黃柏酮17-R-D-glucoside(12)、脫乙酰諾米林酸17-R-D-glucoside(13)、諾米林酸17-R-D-glucoside(14)、異黃柏酮酸17-R-D-glucoside(15)，詳見表2。

表2 葡萄糖苷類檸檬苦素化合物主要結構特征匯總

續表2(Continued Tab.2)

編號No.名稱Name分子式Molecularformulan′n″R1R2R3R4R5R6XYZ主要官能團Mainfunctionalgroup12Obacunone17-β-D-glucosideC32H42O1311與R3成環-與R1成環HOglc1HO-CH=CH內酯、羧酸13Deacetylnomilinicacid17-β-D-glucosideC32H46O1521OHOHHHOglc1HO-CH=CH二羧酸14Nomilinicacid17-β-D-glucosideC34H48O1621OHOAcHHOglc1HO-CH=CH二羧酸、乙酸乙酯15Isoobacunoicacid17-β-D-glucosideC32H44O1421 OHHOglc1HO-CH=CH二羧酸

楝科植物的次級代謝產物-檸檬苦素類化合物是該科植物的主要特征成分，楝科植物中檸檬苦素類物質是由三萜類或具有4，4，8-三甲基-17-呋喃甾類骨架的前體衍生而來，通過環氧化作用和apo-euphol或apo-triucallol重組，逐步形成具有較高生物活性的四環三萜類物質[12]。其中苦楝子酮(melianone)、苦楝子醇(melianol)是代表性楝科檸檬苦素類化合物，詳見圖3。

圖3 苦楝子酮和苦楝子醇結構式

2 檸檬苦素類物質抗病原體特性

2.1 檸檬苦素類物質抗動物源性病原體

2.1.1 抗動物源性致病菌

近年來，隨著抗菌藥物的廣泛應用，細菌耐藥性逐漸增加。有研究表明，天然產物檸檬苦素類物質對李斯特菌、大腸桿菌、結核分歧桿菌等致病菌具有顯著的抑制作用，所以將其作為一種新型抗菌藥物以解決細菌耐藥性問題，具有一定的研究價值，詳見表3所示。

Rahman等[21]以活菌計數法測定檸檬苦素對單增李斯特桿菌的抗菌活性，其結果表明檸檬苦素對ATCC 19116菌株抑制作用最強，最小抑制濃度(minimum inhibitory concentration，MIC)為15.62 μg/mL，敏感性高于ATCC 19111、19166、19118和15313菌株(MIC：31.25～62.5 μg/mL)。

苦楝果實中含量最豐富的檸檬苦素類化合物為3-α-tigloyl-melianol和苦楝萜酸甲酯，Sanna等[22]的研究表明這兩個化合物具有顯著的抗結核分歧桿菌活性，其中3-α-tigloyl-melianol活性最高，MIC值為29 μM，其次是苦楝萜酸甲酯，MIC值為70 μM；最重要的是，發現3-α-tigloyl-melianol使用量在500 μM以下時對Vero細胞沒有細胞毒性，這使其作為抗分歧桿菌劑極具應用價值。

2.1.2 抗動物病毒

迄今為止，多種植物來源的檸檬苦素類化合物已被證實對HIV-1[25,26]、登革熱病毒[27,28]、呼吸道合胞病毒[29]和單純皰疹病毒[30]等具有抗病毒活性，詳見表4所示。

Sanna等[22]研究表明苦楝科苦楝果實中的檸檬苦素類化合物3-α-tigloyl-melianone和苦楝子酮，在半最大效應濃度(EC50)分別為7和3 μM時，對黃熱病病毒均表現出很強的抑制活性。為進一步確定其抗病毒活性，研究將篩選范圍擴大到黃熱病毒屬的其它重要人類病原體，結果表明兩種物質對登革病毒和西尼羅河病毒(west nile virus，WNV)(EC50值在3～11 μM范圍內)也顯示出一定的抑制活性。

Petrera等[31]的研究也表明，苦楝葉中檸檬苦素1-cinnamoyl-3，11-dihydroxymeliacarpin(CDM)在上皮細胞中具有有效的抗皰疹作用。Balestrieri[26]研究了佛手柑提取物(BSext)、檸檬苦素、諾米林對δ逆轉錄病毒人體T細胞白血病病毒1型(HTLV-1)的抑制作用，結果表明檸檬苦素和諾米林對HTLV-1均有抑制活性，抑制50%逆轉錄濃度(RTIC50)分別為0.31±0.01和2.60±0.06 ng/mL。同時發現BSext、檸檬苦素和諾米林等天然來源化合物的細胞毒性顯著低于參考化合物，且結果表明，BSext、檸檬苦素和諾米林對HTLV-1和HIV-1的抗感染作用都是源于它們自身的抗病毒作用，而不是其對細胞產生的毒性作用。

2.2 檸檬苦素類物質抗植物病原體活性

部分天然植物提取物具有抗真菌毒素及抑制不同植物病原體的重要作用[32]。檸檬苦素類化合物作為三萜類化合物的代表物質，研究表明其在一定濃度下足以抵御某些潛在的植物病原菌[33]，因其具有低動物毒性、無神經毒性、在環境中易降解以及避免抗藥性產生等多種優勢，在農業領域被認為是防治植物病原菌的有效候選藥物。

Abdelgaleil等[34]研究了從植物大葉卡雅楝中分離出的10種檸檬苦素類化合物對植物病原真菌灰葡萄孢菌的抗真菌活性，結果表明methyl-angolensate 和1，3，7-trideacetylkhivorin對灰葡萄孢菌的抑菌活性最高，在1000 mg/L時抑菌率分別為62.8%和64.0%，在1500 mg/L時抑菌率分別為73.3%和68.6%。Park等[35]用指示植物法測定了檸檬苦素衍生物anthothecol對銹菌的抑制活性，結果表明當濃度分別為0.5、0.25、0.1 mg/mL時，抑菌率可達90%、76%和53%。

煙草花葉病毒(tobacco mosaic virus，TMV)是一種在世界范圍內廣泛分布的植物病原體，一些重要的經濟作物被其感染后會造成嚴重的經濟損失。Ge等[36]通過半葉法研究發現，當實驗濃度為200 μg/mL時，從單葉地黃連中分離出的8種檸檬苦素類物質都具有抗TMV活性，同時酶聯免疫吸附法結果顯示，兩種檸檬苦素類物質munronoid K和munronoid O在濃度為30 μg/mL時對TMV的復制表現出強烈抑制作用。

3 檸檬苦素類物質抗病原體作用機理

3.1 抗致病菌機理

目前研究表明，多種檸檬苦素類化合物能夠通過影響致病菌群體感應(quorum sensing，QS)從而削弱細菌的致病性[37,38]。群體感應是細菌細胞之間交流的重要機制，根據細菌合成的信號傳遞分子即自誘導劑(autoinducer，AI)和感應機制不同，腸道致病菌使用LuxR/I、LuxS/AI-2和AI-3/腎上腺素介導的幾種群體感應系統來操縱生物膜形成、毒力基因表達等，以在宿主細胞內引發感染并使之持續[39]。結合國內外的相關研究，可將檸檬苦素類物質的抑細菌機理分為以下幾個方面。

3.1.1 抑制信號分子活性、干擾感應系統

弧菌有3種平行的QS系統，其中系統2是LuxS/AI-2系統，感應器是LuxO[39]。Vikram等[40]通過研究幾種檸檬苦素類化合物對哈氏弧菌細胞信號傳導的抑制潛能，發現isolimonexic acid是AI-2活性最有效的抑制劑，IC90=38.90 Μm。此外在100 μg/mL濃度下，isolimonexic acid、宜昌橙苦素能夠使調節應答調節因子LuxO的表達分別下調3.68、23.7倍，從而抑制細菌細胞信號轉導途徑。該作者的另一研究還發現limonexic acid是大腸桿菌O157:H7信號分子AI-3、腎上腺素和感應器激酶QseBC的有效抑制劑。

3.1.2 影響細菌生物被膜形成

細菌生成生物被膜是其為適應自然環境有利于生存的一種生命現象，是致病菌的一個病理特征，受到多種影響因子的復雜調控，包括環境因素和AI-2、AI-3介導的細胞信號。

Vikram[40]的研究表明檸檬苦素類物質能抑制細胞信號，因此，其進一步研究了處理組對致病菌生物膜的影響，結果表明不同檸檬苦素類化合物對哈維氏弧菌生物膜的抑制活性差異顯著(P<0.05)，isolimonexic acid和黃柏酮在最小抑制濃度分別為94.18和91.2 μM時是哈維氏弧菌生物膜最有效的抑制劑。檸檬苦素類物質對大腸桿菌的抑菌活性研究結果也顯示[37]，isolimonexic acid和黃柏酮是腸出血性大腸桿菌生物膜最有效的拮抗劑，以劑量依賴的方式對其產生抑制，IC25和IC50值分別為19.7和116.68 μM。

3.1.3 抑制細菌毒力基因正常表達

腸出血性大腸桿菌含有多種毒力決定因素，如由LEE基因座操控的粘附抹平病理學效應、stx2編碼的志賀毒素、編碼激活轉錄基因flhDC等[41,42]。有學者[40]研究發現在實驗濃度為100 μg/ml的情況下，isolimonexic acid使LEE區編碼的基因表達下調5～10倍，flhD和flhC的表達分別下調4.5、6.9倍，stx2的表達下調4.9倍，ichangin同樣能夠不同程度的抑制這三種基因的表達。沙門氏致病島(salmonella pathogenicity islands，SPIs)是沙門氏菌附著和內化到腸細胞以及在細胞內存活所必需的，研究表明黃柏酮能夠使SPI區內負責編碼TTSS和效應因子的基因ssrA、ssrB表達下調9.7，11.8倍，通過進一步研究發現，經黃柏酮(100 μg/mL)處理，沙門氏菌附著于Caco-2細胞上的數量出現顯著性下降[40]。

3.1.4 對致病菌造成形態學損傷

Rahman等[23]學者測試了檸檬苦素對單核細胞增生李斯特菌的影響，通過掃描電鏡觀察發現，對照組單核細胞增生李斯特菌菌株的形態沒有任何變化，而處理組顯示這些化合物會造成單核細胞增生李斯特菌的形態學損傷，如終點腫脹，細胞壁溶解，部分變形，有孔形成等。Wang等[43]研究發現經檸檬苦素處理的根霉孢子凹陷和皺縮嚴重，檸檬苦素通過破壞根霉細胞壁和細胞膜的完整性，使胞內物質滲出，菌絲體和孢子變形，從而達到抑菌效果(MIC：1 250 μg/mL)。

3.2 抗病毒機理

3.2.1 抑制病毒入侵宿主細胞

Sanna等[22]通過體外細胞實驗證明檸檬苦素類物質3-α-tigloyl-melianol和苦楝子酮對WNV的抑制僅在發生感染的前1 h內有效，如果在病毒感染細胞后的2、4、8 h再添加目標物質，則處理組細胞的存活率與對照組相比無顯著提升，同時兩種化合物不能阻止病毒與細胞受體間的識別和附著，所以研究者推測對病毒的抑制發生在隨后的進入過程。另有研究[44]表明苦楝子提取物(ethanolic extract of Meliae Fructus，EMF)可以有效抑制流感病毒血凝素的活性，從而起到抑制病毒入侵的效果，這是因為血凝素作為流感病毒表面蛋白，與宿主細胞表面的唾液酸受體結合后能促進病毒侵入胞內。

3.2.2 抑制病毒糖蛋白轉運

病毒具有有限的遺傳能力，必須依賴宿主細胞的多種功能才能增殖，病毒糖蛋白在核糖體上合成，經內質網、高爾基氏體到達細胞膜，在此過程中被糖基化。Barquero等[45]將感染水泡性口炎病毒(vesicular stomatitis virus，VSV)后的宿主細胞經CDM處理，間接熒光免疫結果顯示，合成的病毒G-蛋白被限制于高爾基體上，即CDM抑制了G-蛋白向質膜的轉運。Bueno等[46]的研究表明，CDM對轉鐵蛋白受體(TfR)和TNF-α兩種糖蛋白的轉運有短暫的阻斷作用，在不影響細胞糖蛋白生物活性的情況下，CDM引起的糖蛋白轉運延遲對病毒增殖會產生強烈抑制作用，但CDM對TfR與轉鐵蛋白的結合能力沒有影響，對TNF-α的分泌也沒有影響。另一方面，CDM同時干擾了衣殼蛋白、糖蛋白和被膜蛋白在同一HSV-1感染細胞內的定位。

3.2.3 抑制病毒復制和部分基因表達

Botticelli等[47]發現，在人外周血單核細胞(PB-MC)、單核細胞/巨噬細胞培養體系中，檸檬苦素能有效抑制HIV-1的復制且呈現劑量依賴趨勢，EC50為60.0 μmol/L。另一體外細胞實驗[45]表明，分別在VSV病毒感染細胞0～3 h和3～6 h后，向培養基中加入75 μM CDM，對病毒復制的抑制率可分別達到90%和91%。

tax、rex是HTLV病毒基因組的兩個調節基因，其中rex基因可表達兩種對病毒結構有調節作用的蛋白。Balestrieri[26]研究結果表明，佛手柑提取物(BSext)和諾米林在用量10 μg/mL時能完全抑制HTLV-1 tax/rex的表達，檸檬苦素在5 μg/mL濃度下也達到抑制HTLV-1/rex表達的效果，此外研究表明檸檬苦素、諾米林、BSext對HTLV-1逆轉錄酶活性均有抑制作用，其中BSext對酶的抑制最強，為檸檬苦素和諾米林的13和1.2倍。

3.2.4 增強細胞免疫應答

細胞因子是由免疫細胞或某些非免疫細胞經刺激誘導產生一類高活性小分子，如白細胞介素(interleukin，IL)和干擾素(inferferons，IFN)等，具有抗病毒和免疫調節作用。Petrera等[31]學者使用生物測定法和酶聯免疫吸附法測定細胞因子的產生來評價免疫調節作用，研究表明CDM單獨或與2型單純皰疹病毒(HSV-2)組合使用時能增加TNF-α、IFN-γ、IL-6和IL-10等細胞因子的水平。Mx1蛋白作為重要的抗病毒因子，其基因表達受IFN-I型和III型誘導，通過干擾核糖核酸蛋白復合物組裝，并降低病毒聚合酶活性來抑制流感病毒[48]，有研究表明，經EMF處理的犬腎細胞，抗病毒蛋白Mx1明顯上調，這可能在抑制流感病毒感染中發揮一定作用。

4 檸檬苦素類物質吸收代謝途徑

臨床前藥代動力學結果表明檸檬苦素在動物和人體內的血藥濃度較低，生物利用度較差[49,50]。因此研究檸檬苦素類化合物的代謝過程對闡明其藥效物質基礎和作用機制發揮著重要作用。目前，對檸檬苦素類化合物代謝的研究方法主要包括肝微粒體體外代謝法、實驗動物原位腸灌流法及體外細胞實驗代謝產物分析法等。

研究表明，檸檬苦素在整個腸道內均有吸收，但吸收途徑不是簡單的擴散吸收而是促進擴散[51,52]，其吸收主要受P-糖蛋白(P-glycoprotein，P-gp)和細胞色素P450肝酶3A4(CYP3A4)的調節[53,54]。Zhang等[51]采用大鼠小腸原位灌流法研究檸檬苦素在十二指腸、結腸、回腸和盲腸的吸收情況，結果表明吸收速率常數Ka和P值沒有顯著性差異。Han等[53]通過進一步實驗證明說明檸檬苦素的吸收與MRP調節的藥物轉運無關，在P-gp和CYP3A4的調節下維拉帕米和酮康唑能夠以劑量依賴的方式顯著提高檸檬苦素的吸收，而丙磺舒對檸檬苦素吸收的改善效果不明顯，P-糖蛋白的主動外排和細胞色素P450肝酶3A4的首過效應可能是導致其生物利用度低的主要原因之一。

藥代動力學研究表明，檸檬苦素類化合物在體內主要發生Ⅰ相代謝,包括羥基化及氫化[55]，最終經尿液或糞便以原形及代謝產物的形式排出體外[55,56]。Ren等[54]使用超高效液相色譜與高分辨率質譜聯用檢測人肝微粒體(human liver microsomes，HLMs)中四種檸檬苦素的代謝產物，結果表明，在C-7和C-16處的還原、羥基化與還原檸檬苦素類物質的糖基化反應是HLMs中檸檬苦素的主要代謝途徑。

5 結語

檸檬苦素類化合物是蕓香科和楝科植物的次生代謝產物，來源豐富，作為一種新型天然抗病原體活性物質，其在抗動物源性細菌、動物病毒、植物病原菌方面具有廣泛的應用前景。近年來國內外研究人員對檸檬苦素類化合物進行了大量研究，對其生物活性做了初步的闡明，但對于檸檬苦素類化合物的分子結構、不同功能基團與其抗病原體活性之間的聯系仍處于初步探索階段，如檸檬苦素類化合物在動植物體內存在多種抗病原體的作用機制，但是這些不同的途徑相互滲透、相互影響，需要對其復雜的抗病原菌機制進行更為深入地研究。此外，對于檸檬苦素類化合物經口服在體內吸收率低這一問題，其藥物制備方法可以結合納米微球、納米脂質體、冰片、載藥微囊等技術展開進一步研究和技術更新，以期提高藥物的吸收率。鑒于目前一些研究對植物提取物及其抗毒素功效存在多樣的解釋，迫切需要對這些藥物進行進一步的評價，可通過使用適當的感染模型進行廣泛的體外、臨床前和臨床實驗，系統研究這些藥物發揮作用的機理，為進一步應用奠定理論基礎。