FAM134B介導(dǎo)的自噬在無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡中的作用

謝南昌， 李鈺娟， 李英嬌， 王 翠， 杜麗媛， 孟祥荷， 連亞軍

癲癇是常見的神經(jīng)系統(tǒng)疾病，其中約三分之一為難治性癲癇，因此明確癲癇的發(fā)病機(jī)制及尋找新的治療靶點(diǎn)尤為重要[1]。近年研究表明癲癇發(fā)作導(dǎo)致的腦缺氧缺血、鈣離子紊亂等都會(huì)干擾內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能的動(dòng)態(tài)平衡，引發(fā)大量未折疊或者錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中積累，引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激[2,3]。適度的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激可以使應(yīng)激保護(hù)因子葡萄糖調(diào)蛋白78(glucose regulating protein 78,GRP78)因子上調(diào)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)。而持續(xù)的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激會(huì)使C/-EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP) 等上調(diào)，引發(fā)細(xì)胞凋亡[4,5]。在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡過(guò)程中，自噬可通過(guò)清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器抑制內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)，減少細(xì)胞凋亡[6]。FAM134B(family with sequence similarity 134,member B)是FAM134網(wǎng)狀蛋白家族中的成員，該蛋白由497個(gè)氨基酸殘基組成，包含1個(gè)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白同源結(jié)構(gòu)域(reticulon-homology domain，RHD)和微管相關(guān)蛋白輕鏈3(microtubule associated protein light chain 3，LC3)結(jié)合域[7]。FAM134B作為自噬受體，可誘導(dǎo)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段化并清除受損內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)動(dòng)態(tài)平衡[8]。最新研究發(fā)現(xiàn)，在人與小鼠體外培養(yǎng)細(xì)胞中，F(xiàn)AM134B在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡方面發(fā)揮重要調(diào)節(jié)作用[9]，但FAM134B介導(dǎo)的自噬在無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡中的作用機(jī)制尚不明確。本研究中，我們利用體外海馬神經(jīng)元癲癇模型，通過(guò)慢病毒載體Lenti-FAM134B及Lenti-FAM134B-shRNA干預(yù)FAM134B表達(dá)，并進(jìn)一步采用選擇性自噬抑制劑3-MA來(lái)明確FAM134B介導(dǎo)的自噬在無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡中的作用。

1 材料與方法

1.1 動(dòng)物與實(shí)驗(yàn)試劑 新生24 h以內(nèi)健康SD大鼠，SPF級(jí)。試劑：無(wú)鎂外液(2.5 mmol/L KCl、145 mmol/L NaCl、10 mmol葡萄糖、0.002 mmol/L甘氨酸、2 mmol/L CaCl2和10 mmol/L HEPES，pH 7.4)；正常細(xì)胞外液(無(wú)鎂外液各成分+1 mmol/L MgCl)；PBS液；RIPA裂解緩沖液；TUNEL試劑盒(購(gòu)自德國(guó)Roche公司)；NSE抗體(購(gòu)自武漢博士德生物公司)；LDH釋放法檢測(cè)試劑盒(購(gòu)自南京建成生物工程研究所)；β-actin、CHOP、LC3B抗體(購(gòu)自美國(guó)CST公司)；GRP78抗體(購(gòu)自美國(guó)Abcam公司)；過(guò)表達(dá)FAM134B慢病毒載體Lenti-FAM134B、慢病毒空載體Lenti-pGV、低表達(dá)FAM134B慢病毒載體Lenti-FAM134B-shRNA(購(gòu)自上海吉?jiǎng)P基因公司)。

1.2 原代海馬神經(jīng)元的培養(yǎng) 無(wú)菌條件分離新生24 h內(nèi)SD大鼠海馬組織，剔除表面血管，并剪成組織塊轉(zhuǎn)移至離心管中，加入0.125%的胰酶消化后加入PBS液終止并離心，棄上清，洗滌后加入種植培養(yǎng)液制成細(xì)胞懸液。以4×105個(gè)/孔的密度將神經(jīng)元細(xì)胞接種于預(yù)先以L-多聚賴氨酸包被的6孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，置于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中。培養(yǎng)4 h后將種植培養(yǎng)液更換為維持培養(yǎng)液。每2 d半量更換維持培養(yǎng)液。通過(guò)免疫組化染色檢測(cè)神經(jīng)元純度，純度>90%時(shí)進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

1.3 大鼠海馬神經(jīng)元癲癇模型的建立與實(shí)驗(yàn)分組

1.3.1 造模 大鼠海馬神經(jīng)元棄掉維持培養(yǎng)液后，使用無(wú)鎂外液沖洗3次，加入無(wú)鎂外液培養(yǎng)3 h誘導(dǎo)海馬神經(jīng)元癲癇模型。

1.3.2 實(shí)驗(yàn)分組 將原代海馬神經(jīng)元隨機(jī)分為：(1)對(duì)照組(CON組)：神經(jīng)元用正常細(xì)胞外液處理3 h;(2)無(wú)鎂誘導(dǎo)組(AE組)：神經(jīng)元用無(wú)鎂外液處理3 h后;(3)Lenti-pGV組(陰性對(duì)照組)：神經(jīng)元由Lenti-pGV轉(zhuǎn)染成功后，繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，用無(wú)鎂外液處理3 h;(4)Lenti-FAM134B組(過(guò)表達(dá)FAM134B組)：神經(jīng)元由Lenti-FAM134B轉(zhuǎn)染成功后，繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，用無(wú)鎂外液處理3 h后;(5)Lenti-FAM134B-shRNA組(低表達(dá)FAM134B組)：神經(jīng)元由Lenti-FAM134B-shRNA轉(zhuǎn)染成功后，繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)，用無(wú)鎂外液處理3 h;(6)3-MA組：神經(jīng)元由Lenti-FAM134B轉(zhuǎn)染成功后，用自噬抑制劑 3-MA處理24 h，用無(wú)鎂外液處理3 h后。各組在正常細(xì)胞外液或無(wú)鎂外液處理3 h后，繼續(xù)用維持培養(yǎng)液培養(yǎng)24 h后進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)(見表1)。

表1 各組神經(jīng)元細(xì)胞處理流程

1.4 NSE染色檢測(cè)神經(jīng)元純度 將神經(jīng)元細(xì)胞接種到有細(xì)胞爬片的24孔板中培養(yǎng)，第7天時(shí)使用NSE染色行神經(jīng)元純度鑒定。吸去各孔培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛固定30 min后，用0.2%的TritonX-100破膜5 min，加入10%的山羊血清孵育1 h。加入NSE一抗，4 ℃孵育過(guò)夜。吸棄一抗，PBS漂洗，加入二抗，避光孵育1 h。PBS漂洗，在載玻片上滴加10 μl含DAPI的抗熒光衰減封片劑，取出細(xì)胞爬片，蓋在載玻片上。隨機(jī)選擇10個(gè)視野熒光顯微鏡下觀察，計(jì)算NSE陽(yáng)性細(xì)胞陽(yáng)性率并取均值，即神經(jīng)元純度。

1.5 LDH釋放法評(píng)估細(xì)胞活力 取各組神經(jīng)元細(xì)胞培養(yǎng)液離心后取上清液，按照LDH試劑盒說(shuō)明書操作加入試劑及待測(cè)樣本，37 ℃溫浴15 min后，加入LDH反應(yīng)液后，37 ℃溫浴15 min后，加入NaOH溶液后利用酶標(biāo)儀于450 nm處測(cè)量各孔吸光度，并計(jì)算LDH釋放率。

1.6 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡 吸出培養(yǎng)液，加入4%的多聚甲醛固定30 min后，用0.2%的TritonX-100破膜5 min，神經(jīng)元加入TUNEL反應(yīng)混合液在37 ℃反應(yīng)1 h，與DAPI在37 ℃反應(yīng)5 min。在熒光顯微鏡下觀察凋亡細(xì)胞，并計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.7 Western blotting檢測(cè)不同蛋白的表達(dá) 加入RIPA裂解緩沖液裂解海馬神經(jīng)元提取蛋白；12% SDS-PAGE凝膠電泳，電泳結(jié)束后將膠上的蛋白質(zhì)條帶轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h。一抗β-actin (1∶1000)、CHOP(1∶500)、GRP78 (1∶500)、LC3B (1∶1000)孵育，在4 ℃過(guò)夜；加入二抗在室溫下孵育1 h。采用Image J軟件分析蛋白條帶。

1.8 慢病毒載體轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞 將海馬神經(jīng)元以2×105個(gè)細(xì)胞/ml的密度置于6孔板上。培養(yǎng)5 d后，分別使用Lenti-FAM134B、Lenti-pGV和Lenti-FAM134B-shRNA轉(zhuǎn)染神經(jīng)元細(xì)胞，感染復(fù)數(shù)為15。培養(yǎng)12 h后，棄去含慢病毒載體的培養(yǎng)液，加入正常培養(yǎng)液；培養(yǎng)72 h后，使用熒光顯微鏡下觀察感染效率，并進(jìn)行下一步干預(yù)及檢測(cè)。

2 結(jié) 果

2.1 神經(jīng)元純度檢測(cè) 采用NSE免疫熒光染色后，熒光顯微鏡下可觀察到神經(jīng)元胞質(zhì)和樹突著紅色熒光，胞核著藍(lán)色熒光。隨機(jī)選取10個(gè)視野熒光顯微鏡下觀察并計(jì)數(shù)，取其均數(shù)計(jì)算得神經(jīng)元純度為95%以上(見圖1)。

2.2 FAM134B對(duì)無(wú)鎂外液海馬神經(jīng)元凋亡的影響 采用LDH釋放法評(píng)估神經(jīng)元活力，LDH釋放率越高，神經(jīng)元損傷程度越重，神經(jīng)元活力越低。與CON組相比，AE組細(xì)胞LDH釋放率明顯升高(P<0.05)；與AE組比較，過(guò)表達(dá)FAM134B組LDH釋放率明顯降低，低表達(dá)AM134B組LDH釋放率明顯升高(P<0.05)；AE組與陰性對(duì)照組比較，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖2)。采用TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡。AE組神經(jīng)元凋亡明顯增加；與AE組相比，過(guò)表達(dá)FAM134B組神經(jīng)元凋亡明顯減少，低表達(dá)FAM134B組神經(jīng)元凋亡增加(P<0.05)；AE組與陰性對(duì)照組比較，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖3)。

2.3 FAM134B對(duì)無(wú)鎂外液致癇神經(jīng)元自噬相關(guān)蛋白的作用 與CON組相比，AE組中LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值增加(P<0.05)；與AE組相比，過(guò)表達(dá)FAM134B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值明顯增加，低表達(dá)FAM134B組LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值減少(P<0.05)。AE組與陰性對(duì)照組比較，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖4)。

2.4 FAM134B對(duì)無(wú)鎂外液致癇神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的作用 AE組GRP78和CHOP的表達(dá)明顯高于CON組(P<0.05)；與AE組相比，過(guò)表達(dá)FAM134B組GRP78和CHOP的表達(dá)明顯降低，低表達(dá)FAM134B組GRP78和CHOP的表達(dá)明顯升高(P<0.05)；AE組與陰性對(duì)照組比較，兩組間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)(見圖5)。

2.5 選擇性自噬抑制劑3-MA對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的影響 采用選擇性自噬抑制劑3-MA阻斷自噬，驗(yàn)證FAM134B是否通過(guò)誘導(dǎo)自噬對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡產(chǎn)生作用。與CON組相比，AE組中GRP78和CHOP的表達(dá)明顯升高，LDH釋放率升高(P<0.05)；與AE組相比，過(guò)表達(dá)FAM134B組GRP78和CHOP表達(dá)降低，LDH釋放率降低(P<0.05)；與FAM134B組相比，3-MA組GRP78和CHOP的表達(dá)升高，LDH釋放率明顯升高(見圖6)。

圖1 神經(jīng)元純度檢測(cè)；圖2 LDH法檢測(cè)海馬神經(jīng)元活力,與CON組相比*P<0.05;與AE組相比#P<0.05；圖3 TUNEL法檢測(cè)細(xì)胞凋亡

圖4 各組海馬神經(jīng)元LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ的表達(dá)水平,與CON組比較*P<0.05;與AE組比較#P<0.05；圖5 各組GRP78、CHOP蛋白的表達(dá)水平,與CON組相比*P<0.05;與AE組相比#P<0.05；圖6 各組海馬神經(jīng)元GRP78、CHOP的表達(dá)水平,(B)LDH法測(cè)定各組細(xì)胞活力,與CON組比較*P<0.05；與AE組比較#P<0.05；與Lenti-FAM134B組比較**P<0.05

3 討 論

近期研究表明，應(yīng)激條件下FAM134B介導(dǎo)的自噬可維持內(nèi)質(zhì)網(wǎng)穩(wěn)態(tài)，對(duì)細(xì)胞存活至關(guān)重要[8]。本研究發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)FAM134B對(duì)無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡發(fā)揮保護(hù)作用，而低表達(dá)FAM134B發(fā)揮相反作用。且進(jìn)一步采用選擇性自噬抑制劑3-MA干預(yù)后，消除了過(guò)表達(dá)FAM134B對(duì)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及神經(jīng)元凋亡的保護(hù)作用，表明FAM134B可能通過(guò)調(diào)控自噬途徑對(duì)無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和神經(jīng)元凋亡發(fā)揮保護(hù)作用。

研究表明，低表達(dá)FAM134B導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膨脹與擴(kuò)張，過(guò)表達(dá)FAM134B則加速內(nèi)質(zhì)網(wǎng)碎解并促進(jìn)溶酶體降解調(diào)節(jié)自噬[10]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激時(shí)，激活的鈣調(diào)素依賴性蛋白激酶2β(CAMK2B)可磷酸化FAM134B中RHD，進(jìn)一步增強(qiáng)FAM134B寡聚化和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)片段化[11]。同時(shí)FAM134B通過(guò)LC3結(jié)合域募集自噬相關(guān)蛋白LC3并與之相互作用，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)裂解為可被自噬小體包裹的碎片，并加速與溶酶體的融合降解進(jìn)而發(fā)揮調(diào)節(jié)自噬作用[8]。本研究顯示，過(guò)表達(dá)FAM134B使無(wú)鎂致癇海馬神經(jīng)元中自噬標(biāo)記物L(fēng)C3-Ⅱ/LC3-Ⅰ比值顯著增加，同時(shí)我們還發(fā)現(xiàn)過(guò)表達(dá)FAM134B可使AE誘導(dǎo)的LDH釋放率明顯降低，并減少癲癇海馬神經(jīng)元凋亡，而低表達(dá)FAM134B發(fā)揮相反作用。這提示FAM134B可能通過(guò)調(diào)控自噬對(duì)癲癇海馬神經(jīng)元發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用。

近年研究表明，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激與癲癇發(fā)病機(jī)制密切相關(guān)[12]。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激主要通過(guò)激活未折疊蛋白反應(yīng)(unfolded protein response，UPR)維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[13]。當(dāng)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激發(fā)生時(shí)，GRP78與蛋白激酶樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶(PERK)、肌醇需要酶l(IRE1)、激活轉(zhuǎn)錄因子6(ATF6)解離激活UPR清除錯(cuò)誤折疊蛋白質(zhì)，促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能恢復(fù)[14]。當(dāng)UPR不能有效減輕內(nèi)質(zhì)網(wǎng)壓力，細(xì)胞將啟動(dòng)CHOP通路等凋亡途徑誘導(dǎo)細(xì)胞死亡[15]。CHOP作為促凋亡因子,可消耗細(xì)胞谷胱甘肽增加細(xì)胞對(duì)氧化應(yīng)激的敏感性、上調(diào)促凋亡基因表達(dá)、下調(diào)抗凋亡基因bcl-2表達(dá)[16]。本研究發(fā)現(xiàn)，癲癇可導(dǎo)致GRP78和CHOP表達(dá)增加，而過(guò)表達(dá)FAM134B可降低GRP78和CHOP的表達(dá)，低表達(dá)FAM134B發(fā)揮相反作用。這表明癲癇可激活內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激，而過(guò)表達(dá)FAM134B可緩解癲癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)。用3-MA干預(yù)可顯著增加GRP78和CHOP的表達(dá)，并增加LDH釋放率，提示抑制自噬可明顯消除過(guò)表達(dá)FAM134B對(duì)無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及凋亡的保護(hù)作用。因此，本研究表明FAM134B可能通過(guò)調(diào)控自噬緩解無(wú)鎂外液致癇海馬神經(jīng)元內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激及減少神經(jīng)元凋亡。我們認(rèn)為FAM134B有可能成為癲癇治療的新靶點(diǎn)。