文心蘭高效再生體系的建立

李雪青 盛玉輝 付瑛格 周揚(yáng) 趙瑩 凌鵬 宋希強(qiáng) 王健

摘要：【目的】建立文心蘭高效再生體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良提供科學(xué)依據(jù)?！痉椒ā恳晕男奶m檸檬綠的無(wú)菌苗葉片為材料，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)其原球莖誘導(dǎo)的影響，開(kāi)展增殖、生根及移栽研究，建立其高效穩(wěn)定的再生體系。【結(jié)果】影響文心蘭原球莖誘導(dǎo)的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主次排序?yàn)檩烈宜幔∟AA）>噻苯?。═DZ）>6-芐氨基嘌呤（6-BA），在1/2MS培養(yǎng)基中添加0.5 mg/L NAA、0.5 mg/L 6-BA和0.3 mg/L TDZ的誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.0%。培養(yǎng)基中活性炭含量及碳水化合物種類(lèi)對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響存在明顯差異，不同活性炭含量處理間的原球莖增殖系數(shù)存在顯著差異（P<0.05，下同），添加1.0 g/L活性炭較添加0.5 g/L活性炭的增殖系數(shù)顯著升高，不同碳水化合物種類(lèi)間的原球莖增殖系數(shù)排序?yàn)楹Ｔ逄?麥芽糖>蔗糖，最佳增殖和分化培養(yǎng)基為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。添加10%椰子水的文心蘭幼苗生根數(shù)顯著高于添加10%香蕉汁和10%蘋(píng)果汁，每株平均生根量接近4.00條，即生根效果最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水。移栽過(guò)程中根部用水苔包裹后再移至椰糠中，保證光照、水分適宜，適當(dāng)添加緩釋肥，移栽成活率可達(dá)100%。【結(jié)論】利用海藻糖或麥芽糖作為碳源的文心蘭原球莖增殖效果較優(yōu)，生根數(shù)和生根質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯;不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、碳源和有機(jī)物的添加對(duì)文心蘭組織培養(yǎng)具有明顯的促進(jìn)效果。

關(guān)鍵字： 文心蘭;再生體系;原球莖;增殖;生根;移栽

中圖分類(lèi)號(hào)： S682.31? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2020）05-1169-07

Abstract：【Objective】In order to provide support for the varieties improvement of Oncidium using transgenic technology， an efficient regeneration system was established. 【Method】 Leaves of sterile plantlets of Oncidium Lemon Green were used as materials. The effects of different plant growth regulators for the induction of protocorms were researched. The proliferation， rooting and transplanting methods were studied and the efficient regeneration system was established.【Result】The most efficient plant growth regulator for the protocorm induction was naphthaleneacetic acid （NAA）， followed by thiabendron（TDZ） and 6-benzylaminopurine（6-BA）. 1/2MS medium with 0.5 mg/L NAA， 0.5 mg/L 6-BA and 0.3 mg/L TDZ harvested the highest induction rate of 48.0%. The different activated charcoal contents and carbohydrates in media had obvious different effects on protocorm proliferation efficiency， protocorm proliferation times treated by different activated charcoal contents had significant difference. The treatment of 1.0 g/L activated charcoal significantly increased proliferation coefficient than that of 0.5 g/L. Protocorm proliferation coefficients of different carbohydrates was trehalose>maltose>sucrose. The optimal medium for proliferation and differentiation was 1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L activated charcoal+20 g/L trehalose. The rooting number of Oncidium seedlings in the medium with 10% coconut juice was significantly higher than that with 10% banana juice or 10% apple juice， and the average root number per plant was about 4.00. The best rooting medium was 1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10% coconut juice. The roots were then wrapped with moss and the shoots were moved in coconut husk， and the survival rate of transplanted plantlets could reach 100% in the proper light and moisture environment while the slow-release fertilizers were used appropriately. 【Conclusion】Trehalose or maltose as carbon source can obviously improve the proliferation of protocorms of Oncidium，while the root number and quality are greatly increased. The different ratios of plant growth regulators， the different carbon source types and organic matters have obvious promotion effects on regeneration of Oncidium.

Key words： Oncidium; regeneration system; protocorm; proliferation; rooting; transplanting

Foundation item： Hainan Major Science and Technology Project（zdkj201815）; Operation Service Reward Project of National Forest Germplasm Resources Service Platform（hdzkpt2019001）

0 引言

【研究意義】文心蘭（Oncidium）又名舞女蘭、跳舞蘭，是蘭科（Orchidaceae）文心蘭屬（Oncidium）植物，原產(chǎn)于美洲熱帶和亞熱帶地區(qū)（Chase et al.，2009;徐小雁等，2011;王安石等，2015）。因其花序分枝良好、花形優(yōu)美、花色亮麗，被插花界譽(yù)為切花“五美人”之一，具有較高的觀賞價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值（邵寒霜等，2000;陳華和范燕萍，2012;吳曉佩，2017）。近年來(lái)，文心蘭作為重要的切花和盆花種類(lèi)，其市場(chǎng)需求量急劇增加，成為洋蘭類(lèi)的新寵（李力，2016）。海南是我國(guó)文心蘭切花的主要產(chǎn)區(qū)之一（柯海麗等，2012），但切花品種以黃色為主，花色較單一，且無(wú)香味，不符合人們?nèi)找娑鄻踊男枨螅嬖诒皇袌?chǎng)淘汰的風(fēng)險(xiǎn)。利用成熟的基因工程技術(shù)可快速培育具備多種花色和香味的文心蘭新品種，對(duì)促進(jìn)文心蘭產(chǎn)業(yè)可持續(xù)發(fā)展具有重要意義，而建立文心蘭高效再生體系是實(shí)施基因工程的前提條件?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】目前，有關(guān)蘭科植物再生體系的建立已有較多報(bào)道。樊家榮等（2014）利用1/2MS培養(yǎng)基對(duì)大花蕙蘭（Cymbidium hybridum）鱗莖進(jìn)行類(lèi)原球莖誘導(dǎo)，得出植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑的最佳濃度配比為0.5 mg/L 6-芐氨基嘌呤（6-BA）+0.2 mg/L萘乙酸（NAA），增殖分化的最佳天然復(fù)合物為150 mL/L椰汁，添加100 g/L香蕉泥對(duì)幼苗根生長(zhǎng)有顯著促進(jìn)作用。Sherif等（2016）在寶石蘭（Anoectochilus）再生體系研究中提出一種通過(guò)愈傷組織器官發(fā)生并成功誘導(dǎo)形成植株的方法，且證實(shí)利用不同濃度的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑[6-BA、NAA、噻苯?。═DZ）、呋喃氨基嘌呤（KT）、2，4-二氯苯氧乙酸（2，4-D）和吲哚-3-乙酸（IAA）]附加檸檬酸、蛋白胨、椰子水和香蕉泥等天然復(fù)合物能有效提高愈傷組織的增殖率。盧娟（2017）發(fā)現(xiàn)采用低濃度的6-BA附加椰汁和香蕉泥等天然復(fù)合物可促進(jìn)蝴蝶蘭（Phalaenopsis aphrodite Rchb. F.）原球莖增殖。在文心蘭方面，Chen和Chan（2000）以花莖再生植株的節(jié)間、葉片和根尖為材料，采用1/2MS培養(yǎng)基附加適宜比列TDZ和2，4-D及1 g/L蛋白胨暗培養(yǎng)4～7周，成功誘導(dǎo)出胚性愈傷;金蘋(píng)（2009）以試管苗葉片為材料，利用1/2MS培養(yǎng)基+0.2 mg/L 6-BA+1.0 mg/L NAA成功誘導(dǎo)出原球莖;張超等（2010）探討不同基本培養(yǎng)基、碳源和植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)原球莖增殖的影響，結(jié)果表明，MS為原球莖的最佳增殖培養(yǎng)基，10 g/L果糖為原球莖的最佳增殖碳源，0.01～0.10 mg/L NAA能促進(jìn)原球莖增殖，且單獨(dú)添加1.0 mg/L 6-BA時(shí)原球莖的增殖效果優(yōu)于與NAA配合使用;林鶴延（2012）以文心蘭和石斛蘭（Dendrobium nobile）原球莖為材料進(jìn)行蘭花反義ACS基因轉(zhuǎn)化并對(duì)轉(zhuǎn)基因蘭花原球莖進(jìn)行繼代培養(yǎng)與再生;黃霞和盧禹（2016）通過(guò)分析不同濃度配比TDZ和2，4-D對(duì)文心蘭愈傷組織增殖的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)添加1.0 mg/L TDZ和3.0 mg/L 2，4-D后，從接種的類(lèi)原球莖（PLBs）上可誘導(dǎo)出乳白色、較疏松的愈傷組織，誘導(dǎo)率達(dá)100%，成功建立了文心蘭高頻再生體系;王亞平等（2016）以迷你文心蘭玉香和金香為材料，建立了迷你文心蘭的離體快繁技術(shù)體系;葉秀仙等（2016）以文心蘭豹斑寶石的花梗為外植體，探究其叢生芽誘導(dǎo)、增殖和生根等關(guān)鍵環(huán)節(jié)的影響因素，旨在建立叢生芽組培快繁體系;馬蘭（2019）以1/2N6培養(yǎng)基+0.2 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為文心蘭繼代增殖及幼苗生長(zhǎng)培養(yǎng)基取得良好效果?！颈狙芯壳腥朦c(diǎn)】檸檬綠是海南文心蘭切花的主要品種之一，經(jīng)濟(jì)價(jià)值高，可作為改良花色花香的品種，但至今未見(jiàn)有關(guān)該品種再生體系建立的研究報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問(wèn)題】以文心蘭檸檬綠的無(wú)菌苗葉片為材料，探討不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比對(duì)其原球莖誘導(dǎo)的影響，開(kāi)展增殖、生根及移栽研究，進(jìn)而建立高效再生體系，為利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)進(jìn)行品種改良提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

文心蘭檸檬綠無(wú)菌苗由海南博大蘭花科技有限公司提供。

1. 2 原球莖誘導(dǎo)

取生長(zhǎng)健壯、完整的無(wú)菌苗幼葉，切成長(zhǎng)1.0 cm、寬0.5 cm的葉片片段，在1/2MS培養(yǎng)基中添加不同濃度的NAA（0、0.5和2.0 mg/L）、6-BA（0、0.5和1.0 mg/L）和TDZ（0、0.3和0.6 mg/L）等植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑組合，按正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)L9（3）4進(jìn)行優(yōu)化，每處理接種外植體30個(gè)，重復(fù)3次，置于組培室中培養(yǎng)7周后觀察誘導(dǎo)效果，并統(tǒng)計(jì)其誘導(dǎo)率和死亡率。誘導(dǎo)率（%）=誘導(dǎo)數(shù)/接種數(shù)×100，死亡率（%）=死亡數(shù)/接種數(shù)×100，其中誘導(dǎo)數(shù)為誘導(dǎo)出原球莖的數(shù)目。

1. 3 原球莖增殖及分化

將原球莖接種在4種不同培養(yǎng)基中進(jìn)行增殖與分化培養(yǎng)，每種培養(yǎng)基接種原球莖50粒，重復(fù)3次。培養(yǎng)基①：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+0.5 g/L活性炭+30 g/L蔗糖;培養(yǎng)基②：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+30 g/L蔗糖;培養(yǎng)基③：1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L麥芽糖;培養(yǎng)基④：1/2 MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。培養(yǎng)30 d后統(tǒng)計(jì)增殖粒數(shù)并計(jì)算增殖系數(shù)，增殖系數(shù)=（現(xiàn)有粒數(shù)-原有粒數(shù)）/原有粒數(shù)，比較分析培養(yǎng)基中活性炭含量及不同碳水化合物對(duì)增殖的影響。培養(yǎng)60 d后統(tǒng)計(jì)分化數(shù)并計(jì)算分化率，分化率（%）=分化原球莖數(shù)/總原球莖數(shù)×100。

1. 4 生根培養(yǎng)

以不添加天然復(fù)合物的培養(yǎng)基1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA為對(duì)照，將分化出的幼苗接種于添加不同天然復(fù)合物（分別為10%的香蕉汁、椰子汁或蘋(píng)果汁）的培養(yǎng)基中進(jìn)行生根培養(yǎng)，每處理接種30個(gè)幼苗，重復(fù)3次。培養(yǎng)60 d后觀察生根情況、統(tǒng)計(jì)生根數(shù)，并計(jì)算平均生根數(shù)，平均生根數(shù)（條）=生根條數(shù)/原有株數(shù)。

1. 5 移栽

選取株高約4.0 cm、根長(zhǎng)2.0～3.0 cm、生長(zhǎng)健壯的幼苗進(jìn)行移栽。先將已生根的組培苗置于室溫下1 d，然后揭開(kāi)組培瓶蓋在室外散色光下煉苗2～3 d，取出小苗以清水洗凈根部培養(yǎng)基，稍晾干后用水苔包裹幼苗根部，移植到椰糠基質(zhì)中，30 d后統(tǒng)計(jì)成活率。

1. 6 培養(yǎng)條件

除特殊說(shuō)明外，培養(yǎng)基中均添加30 g/L蔗糖和5.8 g/L瓊脂，pH 5.6，光照強(qiáng)度1500 lx，光照時(shí)間12 h/d，培養(yǎng)溫度25 ℃。

1. 7 統(tǒng)計(jì)分析

利用Excel 2013對(duì)試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)處理和制圖，以SPSS 25.0進(jìn)行單因方差分析、LSD多重比較及方差分析。

2 結(jié)果與分析

2. 1 不同濃度NAA、6-BA和TDZ對(duì)文心蘭葉片誘導(dǎo)原球莖的影響

以文心蘭無(wú)菌苗葉片為材料，利用正交試驗(yàn)研究不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑種類(lèi)及濃度對(duì)原球莖誘導(dǎo)的影響。由表1可看出，通過(guò)極差分析發(fā)現(xiàn)因素A（NAA）的R值最大（23.000），而因素B（6-BA）的R值最小（3.567），表明影響文心蘭原球莖誘導(dǎo)的3種植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑主次排序?yàn)镹AA>TDZ>6-BA。結(jié)合誘導(dǎo)率的LSD多重比較分析結(jié)果可知，處理1～3與處理4～9間的原球莖誘導(dǎo)率存在顯著差異（P<0.05，下同），其中，處理5（圖1-A）的誘導(dǎo)率最高，達(dá)48.0%，其次為處理9（圖1-B）。在死亡率方面，處理9的死亡率最低，僅8.0%。方差分析結(jié)果（表2）顯示，NAA對(duì)原球莖誘導(dǎo)率的影響最大，達(dá)顯著水平，而6-BA和TDZ對(duì)誘導(dǎo)率的影響均不顯著（P>0.05，下同）。綜上所述，文心蘭原球莖誘導(dǎo)的最優(yōu)配方組合是A2B2C2，即1/2MS+0.5 mg/L NAA+0.5 mg/L 6-BA+0.3 mg/L TDZ。

2. 2 活性炭含量及碳水化合物種類(lèi)對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響

由圖2可看出，培養(yǎng)基中活性炭含量及碳水化合物種類(lèi)對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響存在明顯差異，以培養(yǎng)基④的增殖系數(shù)最大（2.87），培養(yǎng)基①的增殖系數(shù)最?。?.45）。經(jīng)LSD多重比較發(fā)現(xiàn)，不同活性炭含量處理間的原球莖增殖系數(shù)存在顯著差異，添加1.0 g/L活性炭較添加0.5 g/L活性炭的增殖系數(shù)顯著升高;不同碳水化合物種類(lèi)間表現(xiàn)為添加麥芽糖或海藻糖的原球莖增殖系數(shù)無(wú)顯著差異，但二者均極顯著高于添加蔗糖的增殖系數(shù)，其原球莖增殖系數(shù)排序?yàn)楹Ｔ逄?麥芽糖>蔗糖。即文心蘭原球莖增殖的最佳培養(yǎng)基為1/2MS+4.0 mg/L 6-BA+0.4 mg/L NAA+1.0 g/L活性炭+20 g/L海藻糖。在培養(yǎng)過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，所有增殖的原球莖在原培養(yǎng)基上再經(jīng)30 d左右培養(yǎng)，均可分化出幼苗（圖3），分化率達(dá)100%。

2. 3 不同天然復(fù)合物對(duì)文心蘭幼苗生根的影響

將分化獲得的正常生長(zhǎng)文心蘭幼苗接種在添加不同天然復(fù)合物的培養(yǎng)基（1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA）上進(jìn)行生根培養(yǎng)，其生根率均為100%，但生長(zhǎng)狀況及平均生根數(shù)存在差異。與對(duì)照相比，添加天然復(fù)合物處理的文心蘭幼苗生根數(shù)均極顯著增加（圖4），生長(zhǎng)狀況和顏色也較對(duì)照優(yōu)（圖5）。在不同天然復(fù)合物處理間，添加10%椰子水的生根數(shù)顯著高于添加10%香蕉汁和10%蘋(píng)果汁，每株平均生根量接近4.00條，添加10%香蕉汁和10%蘋(píng)果汁的生根數(shù)間無(wú)顯著差異。因此，文心蘭幼苗生根效果最佳的培養(yǎng)基為1/2MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水。

2. 4 文心蘭生根組培苗的移栽結(jié)果

將生長(zhǎng)良好、具有3～4片葉的文心蘭再生幼苗置于自然室溫下煉苗3～4 d再進(jìn)行移栽，移栽過(guò)程用水苔包裹根部以保證其濕潤(rùn)，轉(zhuǎn)移至椰糠穴盤(pán)中采用水苔椰糠基質(zhì)進(jìn)行幼苗培養(yǎng)（圖6），每隔2～3 d以浸盤(pán)法進(jìn)行澆水，保證光照條件充足，移栽15 d后噴施50%多菌靈可濕性粉劑600～800倍液，并適當(dāng)添加緩釋肥，30 d后其成活率達(dá)100%。

3 討論

NAA和6-BA是常用的植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，對(duì)文心蘭原球莖的增殖和分化具有重要作用（金蘋(píng)，2009）。6-BA與NAA配伍使用既有利于原球莖的增殖及分化，又有利于幼苗生根，可有效提高組培苗質(zhì)量（彭立新等，1999）。本研究結(jié)果表明，不同濃度的6-BA和NAA對(duì)文心蘭原球莖誘導(dǎo)增殖均有影響。在原球莖誘導(dǎo)方面，0.5～1.0 mg/L 6-BA有利于文心蘭原球莖誘導(dǎo)，而NAA濃度為0.5 mg/L的誘導(dǎo)效果最佳，說(shuō)明在一定濃度范圍內(nèi)，6-BA和NAA均有利于文心蘭原球莖誘導(dǎo)，與李力（2016）、曾武清等（2017）、郭艷芳（2018）的研究結(jié)果基本一致;在原球莖增殖方面，較高濃度（4.0 mg/L）6-BA配合較低濃度（0.4 mg/L）NAA可獲得較高的增殖系數(shù)，與崔廣榮等（2005）的研究結(jié)果相似。TDZ具有較強(qiáng)的細(xì)胞分裂活性，低濃度可誘導(dǎo)蘭科植物原球莖或愈傷組織發(fā)生（王濟(jì)紅等，2013）;高濃度則抑制愈傷組織形成，促進(jìn)其分化（徐華松等，1996）。在本研究中，文心蘭原球莖誘導(dǎo)率也受TDZ濃度影響，在0.3～0.6 mg/L范圍內(nèi)，TDZ對(duì)誘導(dǎo)率的提高具有一定促進(jìn)作用，但與未添加TDZ的誘導(dǎo)率無(wú)顯著差異，可能與文心蘭的品種有關(guān)系，具體原因有待進(jìn)一步探究。

碳水化合物是組織胚轉(zhuǎn)化成小植株的重要物質(zhì)（Jheng et al.，2006）。Pullman等（2003）研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)麥芽糖取代蔗糖時(shí)可提高冷杉組織胚的植株轉(zhuǎn)化效率，并促進(jìn)其體細(xì)胞胚成熟，可能是麥芽糖作為一種優(yōu)良的碳水化合物滲透劑在關(guān)鍵時(shí)期能促進(jìn)冷杉組織胚發(fā)育。Jheng等（2006）通過(guò)研究碳源對(duì)文心蘭PLBs形成和植株再生的影響，發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)基中添加麥芽糖和蔗糖對(duì)PLBs的增殖有促進(jìn)作用，但海藻糖較麥芽糖更有利于植株轉(zhuǎn)化。張超等（2010）研究表明，不同碳源對(duì)文心蘭原球莖增殖效果的排序?yàn)楣?蔗糖>葡萄糖>麥芽糖>山梨醇>甘露醇，以添加10 g/L果糖的增殖效果最佳。本研究結(jié)果表明，添加20 g/L海藻糖對(duì)文心蘭原球莖的增殖有促進(jìn)作用，添加麥芽糖也有類(lèi)似作用效果，與Jheng等（2006）的研究結(jié)果基本一致。本研究發(fā)現(xiàn)，添加1.0 g/L活性炭對(duì)文心蘭原球莖增殖有明顯促進(jìn)作用，可能是活性炭能吸附組培過(guò)程中植物分泌的有害次生代謝物質(zhì)。此外，活性炭與不同碳水化合物配伍使用的原球莖增殖效果更好，增殖系數(shù)最高可達(dá)2.87，增殖效果優(yōu)于單獨(dú)使用活性炭（李力，2016）。

在文心蘭生根培養(yǎng)基中添加適量天然復(fù)合物如香蕉汁、椰汁和蘋(píng)果汁等可有效促進(jìn)增殖、生根，究其原因可能是此類(lèi)天然復(fù)合物中富含氨基酸、植物激素、礦物質(zhì)和維生素等營(yíng)養(yǎng)成分（何松林等，2003）。彭曉明等（2000）研究發(fā)現(xiàn)添加香蕉汁、椰乳、番茄汁或蘋(píng)果汁的培養(yǎng)基對(duì)文心蘭增殖和壯苗生根均有促進(jìn)效果;趙麗和田維敏（2008）也發(fā)現(xiàn)在文心蘭高效再生體系中添加10%椰子水及1.0 mg/L IBA能有效誘導(dǎo)生根。至今，已有較多研究證實(shí)添加椰子水和椰乳等能取得良好的原球莖增殖分化效果，可能是椰乳中含有的營(yíng)養(yǎng)成分和生理活性物質(zhì)配比與蘭花原球莖增殖及分化所需的配比一致（張梅等，2019）。在本研究中，最佳生根培養(yǎng)基為1/2 MS+0.8 mg/L 6-BA+0.2 mg/L NAA+10%椰子水，且組培苗根數(shù)多、植株更濃綠、根生長(zhǎng)更健壯，較滿(mǎn)若君（2007）、趙麗和田維敏（2008）的研究效果更優(yōu)。文心蘭原球莖誘導(dǎo)率還與葉片選擇有關(guān)。按照以下要求選擇葉片有利于誘導(dǎo)：葉片長(zhǎng)、寬分別為1.0和0.5 cm，切口平整，不過(guò)嫩（從上到下第1～2片葉子）、不太老（從上到下數(shù)第6片葉子后的葉片），因?yàn)槔先~易變黃，過(guò)嫩葉片則易萎蔫，均不利于誘導(dǎo)。

4 結(jié)論

利用海藻糖或麥芽糖作為碳源的文心蘭原球莖增殖效果較優(yōu)，生根數(shù)和生根質(zhì)量?jī)?yōu)勢(shì)明顯;不同植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑配比、碳源和有機(jī)物的添加對(duì)文心蘭組織培養(yǎng)具有明顯的促進(jìn)效果。

參考文獻(xiàn)：

陳華，范燕萍. 2012. 文心蘭花香成分的分析[J]. 江西農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，34（4）：692-698. [Chen H，F(xiàn)an Y P. 2012. Analysis of aroma components of Oncidium[J]. Acta Agriculturae Universitatis Jiangxiensis，34（4）：692-698.]

崔廣榮，劉士勛，何玉華，劉云兵，谷業(yè)理. 2005. 外源激素、芽苗數(shù)及大小對(duì)文心蘭試管苗增殖的影響[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，26（2）：45-49. [Cui G R，Liu S X，He Y H，Liu Y B，Gu Y L. 2005. Effects of hormones，shoot length and number on Oncidium shoot propagation[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，26（2）：45-49.]

樊家榮，孟想想，曹可. 2014. 大花蕙蘭組培快繁技術(shù)研究[J]. 生物學(xué)雜志，31（6）：99-102. [Fan J R，Meng X X，Cao K. 2014. Research on rapid propagation technology of tissue culture of Cymbidium[J]. Journal of Biology，31（6）：99-102.]

郭艷芳. 2018. 巧克力文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及抗病基因克隆與表達(dá)分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué). [Guo Y F. 2018. Optimization of the in vitro culture conditions， cloning and expression analysis of disease resistance related genes in Oncidium sharry baby[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.]

何松林，孔德政，楊秋生，張啟翔，田中道男. 2003. 碳源和有機(jī)添加物對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響[J]. 河南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)，37（2）：154-157. [He S L，Kong D Z，Yang Q S，Zhang Q X，Tanaka D. 2003. Effect of carbon sources and organic compounds on the multiplication of Oncidium aloha ?Iwanaga? PLB[J]. Journal of Henan Agricultural University，37（2）：154-157.]

黃霞，盧禹. 2016. 文心蘭類(lèi)原球莖的愈傷組織誘導(dǎo)及其植株再生[J]. 廣西植物，36（9）：1082-1086. [Huang X，Lu Y. 2016. Callus induction and plant regeneration of Onci-dium ‘Gower Ramsey by means of protocorm-like body culture[J]. Guihaia，36（9）：1082-1086.]

金蘋(píng). 2009. 根癌農(nóng)桿菌介導(dǎo)ACS反義基因轉(zhuǎn)化文心蘭的研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué). [Jin P. 2009. Studies on the tranformation of antisense ACS gene mediated by Agrobacterium tumefaciens in Oncidium[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.]

柯海麗，黎維詩(shī)，劉冬梅，凌緒柏. 2012. 文心蘭切花品種的栽培比較研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，40（34）：16556-16557. [Ke H L，Li W S，Liu D M，Ling X B. 2012. Cultivation comparison for cut-flower cultivars of Oncidium[J]. Journal of Anhui Agricultuarl Sciences，40（34）：16556-16557.]

李力. 2016. 文心蘭離體培養(yǎng)技術(shù)研究[J]. 農(nóng)村經(jīng)濟(jì)與科技，27（20）：38. [Li L. 2016. Study on in vitro culture technology of Oncidium[J]. Rural Economy and Technology，27（20）：38.]

林鶴延. 2012. 轉(zhuǎn)基因蘭花培養(yǎng)物繼代保持及文心蘭ACO基因克隆與表達(dá)分析[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué). [Lin H Y. 2012. Studies on maintenance of orchid transgenic cultures and cloning and expression analysis of ACO in Oncidium[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.]

盧娟. 2017. 蝴蝶蘭花梗腋芽組織培養(yǎng)探究[J]. 南方農(nóng)業(yè)，11（9）：117-118. [Lu J. 2017. Study on tissue culture of axil-lary bud of phalaenopsis pedicel[J]. South China Agriculture，11（9）：117-118.]

馬蘭. 2019. 文心蘭的莖尖及花梗組織培養(yǎng)和快速繁殖探討[J]. 現(xiàn)代園藝，（2）：15-16. [Ma L. 2019. Study on the ti-ssue culture and rapid propagation of shoot tip and pedicel in Chinese orchid[J]. Current Horticulture，（2）：15-16.]

滿(mǎn)若君. 2007. 蝴蝶蘭、文心蘭再生體系的建立及遺傳轉(zhuǎn)化體系的初步研究[D]. 南寧：廣西大學(xué). [Man R J. 2007. Preliminary studies on regeneration and transformations systems of Phalaenopsis and Oncidium[D]. Nanning：Guangxi University.]

彭立新，王姝，孟廣云. 1999. 蝴蝶蘭組織培養(yǎng)快繁研究[J]. 天津農(nóng)業(yè)科學(xué)，5（2）：29-31. [Peng L X，Wang S，Meng G Y. 1999. Study on tissue culture and rapid propagation of Phalaenopsis[J]. Tianjin Agricultural Sciences，5（2）：29-31.]

彭曉明，曾宋君，張京麗，趙逢畔. 2000. 文心蘭的莖尖及花梗組織培養(yǎng)和快速繁殖[J]. 園藝學(xué)報(bào)，127（2）：127-129. [Peng X M，Zeng S J，Zhang J L，Zhao F P. 2000. In vitro propagation of Oncidium by bud and inflorescence culture[J]. Acta Horticulturae Sinica，127（2）：127-129.]

邵寒霜，李繼紅，王勝培. 2000. Lfy cDNA高效單子葉植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化蘭花研究初報(bào)[J]. 熱帶作物學(xué)報(bào)，21（3）：58-62. [Shao H S，Li J H，Wang S P. 2000. Construction and transformation of high efficient monocot expression vector into orchid[J]. Chinese Journal of Tropical Crops，21（3）：58-62.]

王安石，林明光，陳施明，韓松，潘英文. 2015. 不同栽培基質(zhì)對(duì)文心蘭組培苗生長(zhǎng)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，46（3）：462-465. [Wang A S，Lin M G，Chen S M，Han S，Pan Y W. 2015. Effects of different substrates on transplanting survival rate and growth of Oncidium plantlet[J]. Journal of Southern Agriculture，46（3）：462-465.]

王濟(jì)紅，劉燕，向立容，祁翔. 2013. 文心蘭組培育苗初誘導(dǎo)關(guān)鍵技術(shù)研究[J]. 貴州師范大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），31（2）：1-6. [Wang J H，Liu Y，Xiang L R，Qi X. 2013. Key technical research for induction of the tissue culture seedling of Oncidium[J]. Journal of Guizhou Normal University（Natural Sciences），31（2）：1-6.]

王亞平，王燕君，譚志勇，張樂(lè)萍，曾美琴. 2016. 迷你文心蘭組培快繁技術(shù)研究[J]. 現(xiàn)代農(nóng)業(yè)科技，（3）：181-183. [Wang Y P，Wang Y J，Tan Z Y，Zhang L P，Zeng M Q. 2016. Study on rapid propagation technogy of tissue culture of mini Oncidium[J]. Modern Agricultural Science and Technology，（3）：181-183.]

吳曉佩. 2017. 文心蘭離體培養(yǎng)優(yōu)化及轉(zhuǎn)化鐵氧還蛋白基因研究[D]. 福州：福建農(nóng)林大學(xué). [Wu X P. 2017. Optimization of Oncidium in vitro culture system and transformation ananlysis of Ferredoxin genes[D]. Fuzhou：Fujian Agriculture and Forestry University.]

徐華松，徐九龍，黃學(xué)林. 1996. TDZ在植物組織培養(yǎng)中的作用[J]. 廣西植物，16（1）：77-80. [Xu H S，Xu J L，Huang X L. 1996. Effect of TDZ on plant tissue culture[J]. Guihaia，16（1）：77-80.]

徐小雁，龍明華，田敏. 2011. 文心蘭花期及花形態(tài)結(jié)構(gòu)研究[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，42（6）：651-653. [Xu X Y，Long M H，Tian M. 2011. Morphological changes associated with different flowering stages of Oncidium variety Milliongolds[J]. Journal of Southern Agriculture，42（6）：651-653.]

葉秀仙，黃敏玲，羅遠(yuǎn)華，林榕燕，鐘淮欽. 2016. 盆花文心蘭叢生芽組培快繁技術(shù)研究[J]. 福建農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，31（11）：1198-1203. [Ye X X，Huang M L，Luo Y H，Lin R Y，Zhong H Q. 2016. Bud tissue culture and rapid propagation of potted flower，Oncidum[J]. Fujian Journal of Agricultural Sciences，31（11）：1198-1203.]

曾武清，陳柳嬋，曾瑞珍，易懋升，宿慶連，郭和蓉，黎揚(yáng)輝，謝利. 2017. 麗影和紅韻蝴蝶蘭快速繁殖試驗(yàn)[J]. 廣東農(nóng)業(yè)科學(xué)，44（8）：55-60. [Zeng W Q，Chen L C，Zeng R Z，Yi M S，Su Q L，Guo H R，Li Y H，Xie L. 2017. Micropropagation of Phalaenopsis‘Liyingand‘Hongyun[J]. Guangdong Agricultural Sciences，44（8）：55-60.]

張超，榮松，張茜茜，樓楠男. 2010. 基本培養(yǎng)基、碳源及植物生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑對(duì)文心蘭原球莖增殖的影響[J]. 浙江農(nóng)業(yè)科學(xué)，（1）：55-59. [Zhang C，Rong S，Zhang Q Q，Lou N N. 2010. Effects of basic medium，carbon source and plant growth regulator on growth of Oncidium protocorm[J]. Journal of Zhejiang Agricultural Sciences，（1）：55-59.]

張梅，胡瑾，周艷，李君一，馮佑鴻，李依蔓. 2019. 白花兜蘭的無(wú)菌播種和離體快速繁殖[J]. 種子，38（3）：45-49. [Zhang M，Hu J，Zhou Y，Li J Y，F(xiàn)eng Y H，Li Y M. 2019. Tissue culture and rapid propagation of Paphiopedilum emersonii[J]. Seed，38（3）：45-49.]

趙麗，田維敏. 2008. 文心蘭高效再生體系研究[J]. 安徽農(nóng)業(yè)科學(xué)，36（20）：8502-8503. [Zhao L，Tian W M. 2008. Study on the high-efficient regeneration system of Onci-dium[J]. Journal of Anhui Agricultuarl Sciences，36（20）：8502-8503.]

Chase M W，Williams N H，de Faria A D，Neubig K M，Amaral M C E，Whitten W M. 2009. Floral convergence in Oncidiinae（Cymbidieae;Orchidaceae）：An expanded concept of Gomesa and a new genus Nohawilliamsia[J]. Annals of Botany，104（3）：387-402.

Chen J T，Chan W C. 2000. Efficient plant regeneration through somatic embryogenesis from callus cultures of Oncidium（Orchidaceae）[J]. Plant Science，160（1）：87-93.

Jheng F Y，Do Y Y，Liauh Y W，Chung J P，Huang P L. 2006. Enhancement of growth and regeneration efficiency from embryogenic callus cultures of Oncidium ?Gower Ramsey? by adjusting carbohydrate sources[J]. Plant Scien-ce，170（6）：1133-1140.

Pullman G S，Johnson S，Peter G，Cairney J，Xu N. 2003. Improving loblolly pine somatic embryo maturation：Comparison of somatic and zygotic embryo morphology，germination，and gene expression[J]. Plant Cell Reports，21（8）：747-758.

Sherif N A，Kumar T S，Rao M V. 2016. In vitro regeneration by callus culture of Anoectochilus elatus Lindley，an endangered terrestrial jewel orchid[J]. In Vitro Cellular & Developmental Biology-Plant，52：72-80.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）