SDS-PAGE法分析蜂蜜中蛋白質組分的條件優化

王琴

摘 要：本文從分離膠濃度、凝膠厚度和點樣量方面對SDS-PAGE電泳法進行優化，探究最適合蜂蜜蛋白質分析的SDS-PAGE電泳條件，證明SDS-PAGE電泳法分析蛋白組學的可靠性，為蜂蜜新鮮度和真實性的鑒別提供參考依據。

關鍵詞：蜂蜜;蛋白質;凝膠電泳

中圖分類號：O658.9;S896.1 文獻標識碼：A 文章編號：1003-5168（2020）14-0129-03

Study on the Condition Optimization of SDS-PAGE Analysis of Protein Components in Honey

WANG Qin

（College of Pharmaceutical Engineering， Chongqing Chemical Industry Vocational College， Chongqing 401228）

Abstract： This paper optimized the SDS-PAGE electrophoresis method in terms of separation gel concentration， gel thickness and spot size， explored the SDS-PAGE electrophoresis conditions that were most suitable for honey protein analysis， and proved that the SDS-PAGE electrophoresis analysis was reliable Sex， provided a reference for the identification of honey freshness and authenticity.

Keywords： honey;protein;gel electrophoresis

蜂蜜是蜜蜂采集花蜜或者蜜露在蜂巢中經過充分釀造而成的天然甜物質，除富含糖類物質，還含有少量的蛋白質、氨基酸、維生素和酚酸類等活性成分[1]，因而具有藥食兩用的功效[2]，深受人們的喜愛。

我國是蜂蜜的生產和消費大國，市場上的蜂蜜主要是由中華蜜蜂和意大利蜜蜂釀制的，蜂蜜品質參差不齊，造假摻雜的現象較為普遍。蜂蜜中的蛋白質組分主要來自蜂種，少部分來源于蜜源植物。蜂蜜中的蛋白質會隨著儲藏時間逐漸降解[3]，也受到商業加工的破壞，蜂蜜的蛋白組分完整性可以判定蜂蜜的新鮮程度和真實性，進而反映蜂蜜質量的優劣。SDS-PAGE電泳法可以快速地得出蜂蜜的蛋白組分，可用于蜂蜜質量優劣的判斷。本研究主要探究最適合蜂蜜蛋白質分析的SDS-PAGE電泳條件，驗證SDS-PAGE電泳法分析蜂蜜蛋白質的可靠性。

1 試驗材料與試劑

1.1 樣品

油菜蜜，來源于重慶農家中華蜜蜂蜂蜜，未經加工處理。

1.2 試劑與儀器

主要試劑有氫氧化鈉（NaOH）、三氯乙酸（TCA）、丙酮、β-巰基乙醇、過硫酸銨、1.5 mol/L Tris-HCl（pH 8.8）、1 mol/L Tris-HCl（pH 6.8）、10% SDS、5×SDS的上樣緩沖液、考馬斯亮藍染色液、脫色液。主要儀器有蛋白質電泳儀、彩色圖像掃描儀、電子恒溫水浴鍋。

2 試驗方法

2.1 蜂蜜蛋白質的提取

SDS-PAGE法可以分析蜂蜜中蛋白質的組分，文獻研究顯示，TCA-丙酮法提取蛋白質的含量最高，蛋白條帶種類最多，最適合后續SDS-PAGE[4]對蛋白質的分析。本研究在周莉質等人[5]的方法上進行優化，將油菜蜜4.0 g放入50 mL的離心管中，并放入4 mL無菌水溶解樣品，3 000 r/min離心3 min，上清液加入10 mL的TCA-丙酮溶液（1∶9）混合均勻，離心獲取蛋白質沉淀，再加入1 mL的丙酮-水溶液（1∶1）清洗沉淀，重復清洗3次，純化蛋白沉淀用無菌水定容到1 mL，放置于-20 ℃保存備用。

2.2 SDS-PAGE電泳條件的優化

取的油菜蜜總蛋白原液，加0.25倍的5×SDS的上樣緩沖液混勻，在沸水浴中煮沸5 min，組裝好電泳裝置，加入1×SDS-PAGE電泳緩沖液準備電泳試驗。電泳其他條件為：5%濃縮膠。點樣后電泳：先80 V恒壓20 min，再120 V恒壓，當溴酚藍移動到離底部約0.5 cm時，停止電泳，凝膠染色、脫色。

2.2.1 分離膠濃度試驗。按照凝膠組分配方（見表1）制備8%、12%、15%分離膠，以10 μL點樣量進行蛋白質電泳。表1中，各種試劑的單位均為mL。

2.2.2 分離膠厚度試驗。按照制膠板，采用12%的分離膠，制備厚度為0.75 cm和1.0 cm的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠，以10 μL點樣量進行蛋白質電泳。

2.2.3 點樣量試驗。采用12%分離膠，1.0 cm厚度凝膠，分別在5、10、20 μL點樣量的條件下進行蛋白質電泳。

3 試驗結果

3.1 不同濃度分離膠的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同濃度的分離膠的蜂蜜蛋白質電泳圖如圖1所示，8%的分離膠電泳中標準蛋白分離效果好，但是蜂蜜的蛋白質條帶不夠清晰;15%分離膠的蛋白標準比較集中，不能準確估算蜂蜜的蛋白質分子量;12%的分離膠分離效果是最好的，蜂蜜蛋白條帶清晰，易于估算蛋白質分子量。

3.2 不同厚度凝膠的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同厚度凝膠的蜂蜜蛋白質電泳圖如圖2所示，結果表明，凝膠厚度為1.0的蜂蜜蛋白電泳效果最好，主要是由于蜂蜜中的蛋白質分子量在100 kDa以下，蛋白質組分的分子量比較相近，凝膠越薄，蜂蜜蛋白質遷移越靠近，SDS-PAGE圖上分不開蛋白組分。

3.3 不同點樣量的SDS-PAGE圖譜效果比較

不同點樣量的蜂蜜蛋白質電泳圖如圖3所示，結果表明，點樣量為10 μL的蜂蜜蛋白電泳效果最好。5 μL點樣量的蜂蜜蛋白質條帶偏少，偏低的蛋白組分不可見;20 μL點樣量的電泳圖分不開55 kDa處的蛋白組分，表明點樣的蛋白質含量過多，蜂蜜中總蛋白的含量為0.1%～0.5%[6]，通過TCA-丙酮提取后的蛋白質濃度不高，按照本試驗提取方法，電泳中10 μL點樣量適中。

4 結論

本研究通過比較分離膠的濃度、凝膠厚度發現，蜂蜜蛋白質的最優SDS-PAGE電泳條件是：采用厚度為1.0 cm、濃度為12%的分離膠電泳效果最好。不同方法提取的蜂蜜蛋白質濃度不一樣，建議進行點樣量試驗確定最適點樣濃度，排除蛋白質含量過低，電泳圖檢測不出蛋白組分。本研究表明，SDS-PAGE電泳法分析蜂蜜蛋白質組分，具有可靠性，可從蛋白質角度推斷蜂蜜的品質。

參考文獻：

[1]孫長波，張晶.蜂蜜化學成分研究概況[J].農業與技術，2014（8）：243-248.

[2]馬天琛，王倩，程妮，等.熱加工對蜂蜜質量影響的研究進展[J].食品與發酵工業，2019（14）：245-249.

[3]劉紅云，童富淡，李宜梅等.貯存溫度、時間對蜂王漿水溶性蛋白的影響[J].食品與發酵工業，2003（6）：1-4.

[4]Carpentier S C，Witters E，Laukens K，et al.Preparation of protein extracts from recalcitrant plant tissues：an evaluation of different methods for two-dimensional gel electrophoresis analysis[J].Proteomics，2005（10）：2497-2507.

[5]周莉質，宗凱，呂俠影，等.蜂蜜蛋白提取以及雙向電泳技術分析蜂蜜蛋白條件優化[J].安徽農業科學，2016（3）：85-87.

[6]Brudzynski K，Sjaarda C.Honey glycoproteins containing antimicrobial peptides，Jelleins of the Major Royal Jelly Protein 1，are responsible for the cell wall lytic and bactericidal activities of honey[J].Plos One，2015（4）：120238.