不同濃度血管內皮細胞生長因子對人牙周膜干細胞內皮向分化的影響

石 笑，趙寅華，趙 螢，程百祥，陳永進，張 旻

2004年Seo等[1]利用克隆篩選和免疫磁珠分離的方法分離獲得了牙周膜干細胞(periodontal ligament stem cells, PDLSCs)，并證實其具有高度自我更新能力和多向分化潛能，能夠分化為牙周膜組織中具有特定功能的細胞群，包括成骨細胞、成纖維細胞和成牙骨質細胞，繼而形成骨、成牙骨質及牙周膜纖維結構[1-6]。

對于牙齒撕脫性損傷來說，如何促進延遲再植脫位牙獲得理想的牙周膜性愈合，一直以來都是該領域的研究熱點與難點。本課題組在前期研究中發現，補充外源性PDLSCs能明顯提高脫位再植牙牙周膜性愈合位點的數量，提示自體干細胞的移植可能會成為延遲再植脫位牙牙周損傷修復的新方向[7]。同時，我們還發現，經BrdU標記的外源性PDLSCs明顯參與了新生牙周膜組織中毛細血管管壁的形成，且干細胞植入組中毛細血管的數量多于對照組[7]。上述現象進一步提示我們，PDLSCs的內皮向分化及血管的形成可能是其促進撕脫性損傷患牙牙周愈合的關鍵因素。

然而，為了得到PDLSCs內皮向分化誘導液的理想配比，給后續基于其內皮分化的一系列研究奠定基礎，本研究擬采用含有不同濃度血管內皮細胞生長因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)的內皮向分化誘導液對人PDLSCs的分化效果進行對比研究，以期篩選出適宜的誘導液和誘導時間，為PDLSCs應用于牙周組織修復和再生提供實驗依據和理論基礎。

1 材料與方法

1.1 主要材料與儀器

1.1.1 主要材料 α-MEM(HyClone公司，美國)，2.5 g/L胰酶(HyClone公司，美國)，Ⅰ型膠原酶(Sigma公司，美國)，胎牛血清(杭州四季青公司)，青霉素 100 U/mL(Sigma，美國)，鏈霉素 100 U/mL(Sigma，美國)，MatrigelTM基質膠(BD，美國)，血管內皮細胞生長因子(VEGF165，Cyagen，美國)，堿性成纖維細胞生長因子(bFGF，Cyagen，美國)，胰島素樣生長因子(IGF-1，Cyagen，美國)，小鼠抗人血管性血友病因子(von Willebrand Factor, vWF)抗體(Abcam，美國)，兔抗人血管內皮細胞生長因子受體2(vascular endothelial growth factor receptor-2, VEGFR-2)抗體(Abcam，美國)，兔抗人促血管生成素2(Angiopoietin 2, Ang2)抗體(Abcam，美國)，兔抗人血管內皮生長因子A(VEGFA)抗體(Abcam，美國)，兔抗人IGF-1抗體(Abcam，美國)，cy3羊抗鼠IgG(Abcam，美國)，Alexa Fluor 488羊抗兔IgG(Abcam，美國)。

1.1.2 主要儀器 離心機(Kubota2100，日本)，超凈工作臺(YJ-87，蘇州凈化設備廠)，二氧化碳恒溫培養箱(ThermoForma，美國)，倒置相差顯微鏡(Olympus，日本)，照相系統(Canon 600D，日本)，細胞超聲破碎儀(Sun-ShineBio，中國)，Bio-Rad垂直電泳系統(Bio-Rad公司，美國)，激光共聚焦掃描顯微鏡(Olympus，日本)。

1.2 方法

1.2.1 PDLSCs的分離培養 選取完整拔除的健康成年人(20～30歲，性別不限)阻生智齒，立即置于4 ℃預冷的含雙抗(100 U/mL青霉素；100 U/mL鏈霉素)無菌PBS緩沖液中，轉移至實驗室超凈工作臺內。采用細滴管吸取無菌PBS緩沖液反復沖洗牙根表面，去除牙面污物及牙根表面多余血液。采用11#無菌刀片，輕輕刮除根中1/3區域牙周膜組織，將組織塊切割成大小約 1 mm3的組織塊，連同PBS一起轉移至離心管內，以800 r/min的速度離心5 min，棄上清；加入2 mL Ⅰ型膠原酶，置于37 ℃培養箱內消化15 min；加入2～3 mL 含10% 胎牛血清(FBS)的α-MEM培養液終止消化反應，以800 r/min的速度再次離心5 min，棄上清；加入2～3滴培養液，重懸組織塊后，將其平鋪于培養瓶，加入20 mL 15% FBS的α-MEM培養液，于37 ℃、5% CO2培養箱中培養，每3 d換液1次。待細胞從組織塊邊緣爬出并生長匯合達90%時，采用免疫磁珠法分選牙周膜干細胞，并用含15% FBS的α-MEM培養液培養，2 d換液1次，細胞生長至80%左右時按1∶2傳代培養。

1.2.2 PDLSCs內皮向分化誘導 取生長狀態良好的P3 PDLSCs，經2.5 g/L胰酶消化，以1×105個/孔的密度接種于6孔板，共接種12個6孔板。依照培養液的不同，將上述細胞分為4組，對照組(含10%FBS的α-MEM)、低濃度組(10 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)、中濃度組(20 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)及高濃度組(50 ng/mL VEGF + 10 ng/mL bFGF + 2 ng/mL IGF-1)，每組3個6孔板。將細胞置于37 ℃、5%CO2孵箱中培養，每3 d換液1次，誘導7、14 和21 d后分別進行檢測。

1.2.3 內皮向分化誘導的PDLSCs細胞形態學觀察 取出誘導14 d的對照組、低濃度組、中濃度組、高濃度組細胞，在倒置相差顯微鏡下進行細胞形態觀察，并在不同倍率下拍照記錄。

1.2.4 內皮向分化誘導的PDLSCs基質膠管腔形成實驗 MatrigelTM膠4 ℃過夜凍融，低溫條件下將其置于預冷的24孔板內，每孔200 μL。將24孔板轉移至培養箱中孵育30 min，待膠體凝固。分別消化誘導7、14及21 d的各組細胞，調整細胞密度至2×105個/mL，將細胞懸液以每孔200 μL的量加入MatrigelTM基質膠內，37 ℃、5%CO2孵箱中培養。13 h后采用倒置顯微鏡觀察細胞管腔形成情況，每孔均選擇3個高倍視野進行拍照。采用 Image J分析軟件測量血管樣結構的管腔數及總管腔長度。

1.2.5 內皮向分化誘導的PDLSCs免疫熒光染色 分別取誘導7 d 的4組細胞，調整細胞密度至2×104個/mL，分vWF和VEGFR-2兩組接種于共聚焦小皿中，4%多聚甲醛固定10 min，PBS洗3遍，每次5 min；在vWF組中加入200 μL 1% Triton X-100孵育10 min，PBS洗3遍，每次5 min；1%的BSA封閉液室溫封閉1 h后，棄BSA封閉液，PBS洗3遍，每次5 min；分別加小鼠抗人vWF一抗和兔抗人VEGFR-2一抗，放入濕盒中封閉3 h后，PBS洗3遍，每次5 min；分別加入cy3羊抗鼠IgG二抗和Alexa Fluor 488羊抗兔IgG二抗，避光封閉1 h后，PBS洗3遍，每次5 min；DAPI染核封片后，于激光共聚焦掃描顯微鏡下觀察。誘導14 d和21 d后的細胞也采用同樣方法進行免疫熒光染色。

1.2.6 內皮向分化誘導的PDLSCs Western blotting檢測 使用細胞裂解液裂解誘導7 d 的4組細胞，提取其總蛋白，在10% SDS-PAGE膠中電泳，將蛋白轉膜至PVDF膜上，5%脫脂奶粉封閉2 h后，分別加入VEGFR-2(1∶800)、Ang2(1∶5 000)、VEGFA(1∶3 000)、IGF-1(1∶3 000)、vimentin(1∶500)、GAPDH(1∶7 000)一抗，4 ℃過夜保存，第2天取出膜，PBST漂洗3遍，每次 5 min，分別加入羊抗鼠IgG和羊抗兔IgG二抗反應，室溫搖動孵育2 h，PBST漂洗，化學發光法(ECL)顯影，暗室曝光。

1.3 統計學方法

2 結 果

2.1 PDLSCs形態學觀察

人牙周膜組織塊培養2～5 d后，可見形態呈長梭形的細胞自組織塊爬出，并快速增殖；培養10～12 d后，組織塊周圍可見大量細胞呈放射狀生長(圖1A)。采用免疫磁珠法分離培養，可以獲得呈克隆化生長的牙周膜干細胞(圖1B)，細胞呈長梭形單核細胞，胞體豐滿，胞質均勻，核為卵圓形，大多聚集在胞質中心，胞質形成的突起向外呈放射狀，似成纖維樣細胞(圖1C)。

2.2 誘導后細胞形態觀察

加入不同濃度誘導液后，細胞形態逐漸發生變化，對照組細胞呈長梭形或多角形(圖2A)；低濃度VEGF組細胞變圓潤，呈短梭形，少量細胞呈扁圓形或圓形(圖2B)；中濃度VEGF組細胞大部分呈扁圓形或圓形，少量細胞呈短梭形(圖2C)；高濃度VEGF組細胞基本呈扁圓形或圓形，呈鋪路石樣排列(圖2D)。

圖1 牙周膜干細胞分離培養(倒置相差顯微鏡，A、B： ×100，C： ×1 000)Fig.1 Isolation and culture of periodontal ligament stem cells (inverted phase contrast microscope，A，B： ×100，C： ×1 000)

A：對照組；B：低濃度組；C：中濃度組；D：高濃度組

圖2 不同濃度內皮向分化誘導液作用后牙周膜干細胞形態學改變(倒置相差顯微鏡 ×100)

Fig.2 The morphological changes of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations (inverted phase contrast microscope ×100)

2.3 誘導后PDLSCs成血管能力檢測

誘導后的PDLSCs經Matrigel膠體外三維立體培養13 h后，倒置顯微鏡下觀察可見：未經誘導的對照組PDLSCs均不能形成完整的管腔樣結構，細胞均呈散在分布；而經內皮向分化誘導的各組PDLSCs均可伸出突起并互相連接，形成類似血管的管腔樣結構，其中，以高濃度VEGF組形成的管腔樣結構最為典型，且誘導14 d及21 d組明顯優于誘導7 d組(圖3A)。對典型視野下的圖片采用ImageJ軟件進行分析，PDLSCs在Matrigel膠內形成的管腔數目以及管腔長度均明顯增加(P<0.05)(圖3B)。

2.4 誘導后對PDLSCs vWF和VEGFR-2表達的影響

免疫熒光染色結果顯示，誘導7 d組中的誘導組細胞與未誘導的對照組細胞相比，誘導組細胞中內皮細胞標記物vWF和VEGFR-2的表達無顯著增強(圖4A)，誘導14 d和21 d組中的誘導組細胞較對照組細胞有顯著增強，且隨著誘導液濃度升高，強度逐漸遞增(圖4B、C)，因此可以得出，高濃度誘導液表達效果最好，且誘導14 d和21 d的效果較明顯(P<0.01)(圖4D)。

A：誘導后牙周膜干細胞；B：誘導后管腔數和總管腔長度分析；*：vs.對照組(7 d)P<0.05；#：vs.高濃度組P<0.05

圖3 不同濃度內皮向分化誘導液作用后牙周膜干細胞體外成血管能力

Fig.3 The ability of periodontal ligament stem cells to form blood vesselsinvitroby induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

2.5 誘導后對PDLSCs內皮細胞相關蛋白表達的影響

在免疫印跡試驗中，7 d 組中Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1的誘導組都有所上調，vimentin逐漸下降(P<0.05)(圖5A)；14 d組中，VEGFR-2的誘導組都有明顯上調，Ang2和IGF-1的高濃度組有所上調，VEGFA無明顯上調，vimentin都有所下調(P<0.05)(圖5B)；21 d組中，Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1的誘導組都有所上調，vimentin的誘導組都有所下調，且VEGFR-2和Ang2的高濃度組上調效果和vimentin的高濃度組下調效果較明顯(P<0.05)(圖5C)。

3 討 論

良好的血供是任何組織修復和再生的關鍵，同樣，牙周膜血管微循環的建立與運行與牙周組織功能狀態密切相關[8-10]。對于牙周組織中所有微血管完全斷裂的脫位牙來說，牙周微循環的重建對牙周膜的愈合尤為重要，而誘導PDLSCs向內皮細胞分化并外源性移植可能正是促進牙周膜血運重建而成為促脫位再植牙達到牙周膜性愈合的關鍵因素之一。

在血管發生過程中，最根本最重要的是血管內皮細胞的存在，而外源性植入干細胞的血管內皮向分化則是血管發生的一個重要步驟。有研究發現，VEGF是間充質干細胞或造血干細胞向血管內皮細胞分化的重要條件[11-12]，而VEGFR-2是內皮細胞生長的早期表面受體，主要出現在內皮細胞誘導轉化的早期[13-15]，這也是內皮向分化誘導的條件培養基中添加VEGF和bFGF的根本原因。研究發現，VEGF能特異性促內皮細胞遷移、增殖及形成管腔樣結構[16]， 而 bFGF對VEGF具有非特異性促增殖作用，與VEGF產生協同效應，能夠促進骨髓間充質干細胞分化為內皮細胞和形成小管樣結構，對體外誘導骨髓間充質干細胞或胚胎干細胞分化為內皮細胞具有重要的作用[17]。干細胞分化為內皮細胞后，VEGF又可以誘導內皮細胞發生血管新生，而這一過程是由 RhoA/ROCK信號通路參與介導的[18-19]，VEGF能迅速誘導內皮細胞中RhoA激活，RhoA從胞質轉位到細胞膜上，緊隨RhoA激活之后，VEGFR-2的酪氨酸殘基磷酸化，血管新生增強[18,20]。

A：誘導后7 d；B：誘導后14 d；C：誘導后21 d；D：VEGFR-2和vWF的光密度值；*：vs. 對照組(7 d)P<0.01

圖4 不同濃度內皮向分化誘導液作用后牙周膜干細胞免疫熒光染色

Fig.4 Immunofluorescence of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

A：誘導后7 d；B：誘導后14 d；C：誘導后21 d；**：vs. 對照組P<0.05

圖5 不同濃度內皮向分化誘導液作用后牙周膜干細胞蛋白表達

Fig.5 Protein expression of periodontal ligament stem cells by induced fluid of endothelial differentiation of different concentrations

因此，在本研究中，我們通過從離體牙中獲得牙周膜組織，并培養得到牙周膜細胞，進一步分選獲得牙周膜干細胞培養傳代到第3代，用3種含不同濃度VEGF的內皮向分化誘導液對PDLSCs進行誘導，通過7、14、21 d的誘導后，分別對其進行細胞形態學、體外成血管能力、免疫熒光染色和Western blotting的檢測，進而觀察不同濃度VEGF對人牙周膜干細胞向內皮細胞誘導分化的影響。

實驗結果顯示，從細胞形態學上觀察，可以看到在不同濃度誘導液的誘導下，牙周膜干細胞不同程度地向內皮向分化，且高濃度誘導液的誘導效果相對較好；通過對誘導的牙周膜干細胞進行血管形成實驗，發現誘導組與未誘導組都有成血管效果，而高濃度組的效果最為顯著，并且誘導14和21 d的效果較好；誘導細胞進行免疫熒光染色，7 d組內皮細胞相關蛋白VEGFR-2和vWF沒有明顯變化，14 d組和21 d組都有所上調，高濃度組的表達效果最好；在免疫印跡實驗中，Ang2、VEGFR-2、VEGFA、IGF-1 的誘導組都有所上調，vimentin的誘導組都有所下降，且高濃度組效果較顯著。根據上述結果，我們可以得出結論：高濃度組：50 ng/mL VEGF、10 ng/mL bFGF和2 ng/mL IGF-1的誘導液誘導效果明顯，且14和21 d的誘導效果較好，為通過牙周膜干細胞向內皮細胞分化在延遲脫位再植牙牙周微循環重建中的應用提供了理論依據。然而，牙周微循環重建是多因素影響的復雜生物過程，牙周膜干細胞向內皮細胞誘導分化后移植入體內并對牙周膜愈合的作用如何還有待進一步的研究。