臭氧水溶液對口腔綜合治療臺管道的消毒效果

孫 榮，王 娟，梅予鋒

口腔綜合治療臺水路系統 (dental unit waterlines，DUWLs)在口腔治療中不可或缺，為三用槍、牙科手機、超聲潔牙機等設備供水，在口腔治療中起到沖洗冷卻的作用。然而，這些管道水卻成為了醫院內感染的一個隱患。水路系統管路結構復雜，容易受到微生物污染，微生物附著在口腔綜合治療臺水路系統狹長的塑料內壁上，通過自身的繁殖以及浮游微生物的粘附不斷增厚，形成生物膜。積累到一定厚度的生物膜在水流的沖刷下可全部或部分脫落，隨水流直接進入患者口腔，或是通過渦輪機形成氣霧彌散在空氣中，經由呼吸道進入人體[1]。研究人員在20世紀60年代就發現了這個問題，至今仍未得到完美解決[2-3]。

臭氧的氧化電位較高，是一種強大的廣譜抗菌劑，通過破壞蛋白質、DNA、RNA和脂類對微生物造成損害[4]，從而破壞細胞膜或原生質層，抑制生物膜的形成[5]，對細菌、真菌、病毒、原生動物都有活性[6]。臭氧被廣泛用作飲用水和廢水處理的消毒劑，殺菌強度是氯的1.5倍，并且其抗菌譜比氯和其他消毒劑更廣泛[7]。本研究選用國內自主研發的臭氧水消毒機現場生成臭氧水對DUWLs進行消毒，對比消毒前后水質變化，為臭氧水的臨床應用提供理論依據。

1 材料與方法

1.1 主要設備及材料

安診寶GSV02臭氧水消毒機(廣州市德百順電氣科技有限公司)；口腔綜合治療臺(卡斯特里尼PUMA-ELI，賽福萊，意大利)；R2A培養基(BD，美國)；SCAN/1200 全自動菌落分析儀(Interscience 公司，法國)；需氧恒溫細胞培養箱(Shellab 公司，美國)；超凈工作臺(蘇凈安泰 AirTech)。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣本選擇 選擇南京醫科大學附屬口腔醫院急診綜合科4臺口腔綜合治療臺。4臺治療臺每天均進行常規口腔門診。水路系統均連接經過過濾的城市統一供應的自來水作為水源水。

1.2.2 治療臺消毒方法 每天早上門診開始之前，將治療臺自帶儲水罐用工作濃度臭氧水溶液反復沖洗3次后從安診寶GSV02臭氧水消毒機接取濃度約2.0 mg/L臭氧水溶液，再將儲水罐裝回治療臺，消毒水路管道3 min，消毒完畢后將儲水罐內剩余液體倒掉，排空管道內剩余臭氧水。

1.2.3 水樣采集方法及時間 在開始消毒的第1、3、5、8天，早上門診開始前及下午門診結束后，戴無菌手套及口罩，將三用槍和高速手機出水端約2 cm范圍先用碘伏棉球擦拭第1遍，再換用乙醇棉球擦拭第2遍。安裝已高壓滅菌的三用槍頭和高速手機，兩個樣品采集點分別空放水30 s(早上消毒結束后的樣本采集先空放1 min)，再用高壓滅菌的15 mL離心管接取10 mL水樣，封口，1 h內送入實驗室。

1.2.4 細菌培養與計數 將水樣首先在渦輪震蕩機上振蕩30 s，之后用移液槍吸取1 mL樣品于滅菌15 mL離心管中，用滅菌的PBS分別按1∶10,1∶100,1∶1 000進行梯度稀釋，然后移液槍取適當梯度的液體100 μL均勻涂布于90 mm平皿的R2A培養基上，放置于30 ℃需氧(空氣條件)恒溫培養箱中倒置培養7 d。每份樣品做3個平行樣，并取一個同批次的空白R2A培養基涂布PBS作為陰性對照。培養結束后，用SCAN/1200 全自動菌落分析儀進行菌落計數，計算結果記錄為每毫升菌落密度(CFU/mL)。

1.3 統計學方法

采用SPSS 22.0軟件對數據進行統計分析，用均數±標準差表示水樣菌落數，以消毒前水樣菌落數為基數計算殺菌率，用Tukey-HSD(方差齊)和Dunnett T3(方差不齊)檢驗方法對4個治療臺基線值之間以及第1、3、5、8天消毒前后、門診結束后的菌落數、殺菌率、回升量之間進行多重比較；三用槍和高速手機之間用t檢驗進行比較，檢驗水平α=0.05。

2 結 果

2.1 實驗期間菌量變化及殺菌率

三用槍在消毒前基線水平細菌總數(total viable counts, TVC)為(49 550.00±1 117.52)CFU/mL，高速手機基線水平TVC為(63 875.00±8 842.08)CFU/mL，四個治療臺兩兩比較均無顯著性差異(P=0.840)，兩個采集位點之間有顯著性差異(P=0.018)。第1、3、5、8天三用槍和高速手機出水口水樣TVC繪制成折線圖，可以看出實驗期間DUWLs內微生物污染情況的總體變化趨勢(圖1)。消毒前的檢測結果顯示：兩個位點第1天和第3、5、8天相比有顯著性差異(P<0.01)(表1)。消毒后的結果顯示：三用槍第1天和第8天相比有顯著性差異(P<0.05)，高速手機第1天和第3、5、8天相比有顯著性差異(P<0.05)(表2)。連續8天消毒后三用槍的TVC降低至(83.25±42.99)CFU/mL，高速手機降至(591.50±177.26)CFU/mL。三用槍和高速手機每天的殺菌率平均值分別達到97.48%和95.11%(表3)。三用槍與高速手機之間的t檢驗結果：第1、3、5天消毒前(P=0.018，0.000，0.004)、第1、3、8天消毒后(P=0.006，0.031，0.001)、第1、3、5、8天門診結束后(P=0.002，0.005，0.027，0.007)兩個采集位點之間存在顯著性差異。

圖1 DUWLs三用槍和高速手機出水口水樣TVC折線圖Fig.1 TVC line chart of water samples collected from triple syringes and handpieces

表1 消毒前DUWLs三用槍和高速手機出水口水樣平均TVC比較Tab.1 TVC comparison of water samples collected from triple syringes and handpieces before disinfection

表2 消毒后DUWLs三用槍和高速手機出水口水樣平均TVC比較Tab.2 TVC comparison of water samples collected from triple syringes and handpieces immediately after disinfection

表3 三用槍及高速手機的殺菌率Tab.3 Sterilizing rate of triple syringes and handpieces

2.2 消毒效果的維持

第1、3、5、8天下午門診結束后取樣進行細菌培養，觀察DUWLs經過一天的診療活動后的微生物污染情況，三用槍第1天和第5、8天、高速手機第1天和第3、5、8天門診結束后平均TVC有顯著性差異(P<0.05)(表4)。圖2為第1、3、5、8天門診結束后三用槍及高速手機TVC回升量折線圖，三用槍每天的回升量沒有顯著性差異，高速手機第1天與第3、5、8天之間、第3天與第5、8天之間的差異有統計學意義(P<0.01)，實驗期間每天的細菌回升量呈下降趨勢。

3 討 論

國內外大量研究表明，DUWLs存在嚴重污染，管道水中TVC可為1×104～1×106CFU/mL，其中可檢出芽孢桿菌、軍團菌、假單胞菌、葡萄球菌、克雷伯氏菌、鏈球菌、結核分支桿菌等多種條件致病菌，以及多種真菌、 病毒、原生動物例如白色念珠菌、乙肝病毒、阿米巴原蟲[8-13]等。DUWLs管道狹長，內壁粗糙，近管壁處的水流流速低，且大部分時間管道內水流都處于停滯狀態，水中的微生物易于沉積附著于管壁，這是DUWLs污染嚴重的一個重要原因[14]。污染的來源包括以下兩種，一是水源本身的污染，國內DUWLs供水主要直接采用市政供水系統統一供給的自來水，實驗中測得南京地區自來水中TVC為(33.33±22.31)CFU/mL；二是回吸，牙科手機在停轉的瞬間形成的負壓導致的回吸作用可以將患者口腔內的液體吸入手機，并由手機進入管道系統中[8]，這類污染源更容易導致交叉感染。微生物進入DUWLs后在管道內壁定植形成生物膜，并在水流沖刷作用下部分脫落，隨治療用水直接進入患者口腔，或通過三用槍、牙科手機等形成氣溶膠彌散至診室的空氣中，對患者及醫務工作者尤其是免疫缺陷患者的健康造成威脅。雖然沒有證據表明DUWLs微生物污染會造成廣泛的公共衛生問題，但還是應該盡量減少接觸潛在病原體的風險，為患者和工作人員創造一個安全的工作環境。為控制DUWLs污染現狀，國內外學者進行了大量研究，提出多種改善DUWLs供水質量、減少交叉感染的措施。物理措施包括沖洗、安裝防回吸裝置、安裝過濾膜等，在課題組前期研究中發現安裝防回吸閥的口腔綜合治療臺管道內水質較好[15]，這些方法能夠在一定程度上改善DUWLs輸出水質，但不能清除管道內已形成的生物膜，無法改善DUWLs內的污染情況[16]。化學措施即應用各類消毒劑如氯己定、過氧化氫、戊二醛、次氯酸鈉等，能有效殺滅細菌及真菌，但對浮游狀態的阿米巴原蟲效果甚微，并且這些消毒劑存在一定的不良反應，可能導致DUWLs零件的腐蝕甚至堵塞管道，含氯己定、次氯酸鈉成分的消毒劑對牙本質與復合樹脂的粘結強度有一定的不良影響[17]。

表4 門診結束后DUWLs三用槍和高速手機出水口水樣平均TVC比較Tab.4 TVC comparison of water samples collected from triple syringes and handpieces at the end of the clinic

圖2 門診結束后三用槍及高速手機TVC回升量折線圖Fig.2 TVC recovery line chart of water samples collected from triple syringes and handpieces at the end of the clinic

臭氧具有強氧化性，能殺滅多種微生物，滅活時間短，廣泛應用于水處理及醫療行業[18-22]。Loret等[23]研究發現1.7 mg/L臭氧水溶液可以將阿米巴原蟲濃度降低1～2個數量級。Hikal等[24]研究發現，以500 mg/h流速向水中加入臭氧處理5 min，可100%滅活阿米巴原蟲。楊鑫等[25]研究發現，臭氧濃度為0.6 mg/L 10 min及0.5 mg/L 15 min能將1.97×107copies/L的HBV-DNA滅活。Choudhury等[26]研究發現0.1 mg/L臭氧水溶液在4 min內可使銅綠假單胞菌濃度降低4個數量級，0.04 mg/L臭氧水溶液在2 min內可使耐甲氧西林金黃色葡萄球菌濃度降低5個數量級。宋天一等[27]研究發現，2 mg/L臭氧水溶液沖洗管道1 min后可將水樣中平均菌落數減少到<200 CFU/mL，3 min后平均殺菌率達98.75%。

傳統的臭氧水溶液制備方法是通過高壓電解空氣生成臭氧后溶于水，耗能高、對運行環境要求高、產生氮氧化合物等二次污染物、設備龐大(一般由主機、空氣除濕凈化設備和空壓機組成，占地面積大)、操作復雜、生成臭氧濃度低，并且高壓脈沖會產生放電噪音80 dB以上，高頻放電會產生較強電磁波干擾，對周圍的電器設備及儀器、醫療設備造成損壞。本實驗中使用的臭氧水消毒機采用的是低壓電解原理，通過導電納米金剛石瞬間將水電解為高濃度臭氧水，工作時不受環境和溫度的影響，產物不含氮氧化物，無致癌物質，為目前制備醫用臭氧水領域最快速、便捷、安全的新技術。

由于臭氧具有強氧化性，為減少對口腔綜合治療臺及牙科手機等設備的影響，在保證消毒效果的前提下，應選擇低濃度、短時間(2～4 min) 沖洗的消毒方式[28]，所以本實驗中采用2 mg/L臭氧水溶液沖洗管道3 min的消毒方法進行間歇式消毒。Kohei等[29]對小鼠局部注射208 mmol/L臭氧水溶液，未對正常組織產生任何不良影響；Tun?等[30]研究發現10 mg/L臭氧水溶液對乳牙脫落干細胞的細胞毒性明顯低于臨床上根管沖洗常規使用的1% NaOCl溶液，都遠高于本實驗所用臭氧水溶液的濃度。因此，管道內消毒殘留的少量臭氧可忽略不計其對人體的影響。

目前國內關于DUWLs水質尚沒有專用標準,美國疾病預防控制中心(center for disease control and prevention, CDC)規定的非外科手術牙科治療用水合格標準為異養需氧菌菌落密度≤500 CFU/mL[12]，課題組前期研究從DUWLs中采集的水樣檢出條件致病菌：假單胞菌屬、噬甲基菌屬、埃希菌屬、不動桿菌屬、軍團菌屬、鏈球菌屬、黃桿菌屬[13]，均為專性需氧或兼性厭氧菌，R2A 作為傳統的培養水中異養需氧菌的培養基，可修復被氯損傷的細菌，因此，本研究中樣本采用R2A培養基需氧條件下培養，通過檢測菌量評估臭氧水溶液的消毒效果。實驗中測得消毒前三用槍、高速手機出水口TVC分別為(49 550.00±1 117.52)和(63 875.00±8 842.08)CFU/mL，遠遠超過CDC規定的500 CFU/mL，DUWLs存在嚴重污染。三用槍和高速手機每天的殺菌率平均值分別達到97.48%和95.11%，第5天消毒后三用槍和高速手機TVC的數量級均由消毒前的1×105降至1×102，可見2 mg/L臭氧水溶液能夠顯著改善DUWLs水質。連續8 d消毒后三用槍的TVC降低至(83.25±42.99)CFU/mL，高速手機降至(591.50±177.26)CFU/mL，三用槍第1、3、5、8天消毒后合格率分別為0%、75.00%、50.00%、100%，高速手機第1、3、5、8天消毒后合格率分別為0.00%、0.00%、25.00%、25.00%，并且這4天門診結束后的檢測結果都顯示三用槍和高速手機之間存在顯著性差異，這可能是由于高速手機停轉時存在回吸作用，導致與高速手機相連的管道更易受到污染，管道內微生物數量更多、種類更復雜，形成的生物膜對消毒液有更強的抵抗作用[8]。診療結束后水樣的檢測結果表明，菌落密度明顯回升，但是在實驗周期內，每天的回升量呈下降趨勢，可見該消毒方式雖然持久性欠佳，但持續使用可獲得較好的維持效果。國際上評價水質的指標是菌落數，而并不強調菌群結構和種類，常規大量臨床檢測若要檢測菌群種類，時間和經濟成本很高，不實際，本研究的主要目的是觀察DUWLs經臭氧水溶液處理后的水質是否和國際要求相符，至于臭氧水溶液對DUWLs中具體的某些致病菌及未獲培微生物的影響則有待進一步研究。

綜上所述，該消毒方式能顯著降低DUWLs出水的菌落密度，但需多次消毒才能降至CDC規定的合格標準，分析其原因是由于實驗條件的限制采用了儲水罐消毒法，臭氧性質不穩定，隨時間不斷分解，導致消毒過程中臭氧濃度不斷降低。但是本實驗中所使用的臭氧水消毒機可以通水即刻且持續生成臭氧水溶液，若直接將消毒機與DUWLs相連，則可以解決臭氧濃度損失這個問題，獲得更好的消毒效果。