關于“煙草花葉病毒的感染和重建實驗”的幾個疑惑點探析

盛國躍

摘要：主要以Fraenkel-Conrat H，Williams R C于1955年發表的《Reconstitution of active tobacco mo-saic virus from Its inactive protein and nucleic acid components》（《活性煙草花葉病毒活性蛋白及核酸成分的重組》）Fraenkel-Conrat H，Singer B于1957年發表的《Virus reconstitution：Ⅱ.Combination ofpro-tein and nucleic acidfrom different strains》（《病毒重組：Ⅱ來自不同品系的蛋白質與核酸的結合》）兩篇論文為依據，對學生在學習煙草花葉病毒的感染和重建實驗過程中經常產生的三個疑惑點進行探析。

關鍵詞：煙草花葉病毒 病毒感染 病毒重建

中圖分類號：Q-49 文獻標志碼：E

煙草花葉病毒的感染和重建實驗是證明核酸是遺傳物質的證據鏈中關鍵的一環。學生在學習時，經常h會對該實驗中的幾個操作產生疑惑。其原因有：①在經全國中小學教材審定委員會2004年及2019年初審通過的各個版本高中生物學教材中對這一實驗的介紹都很少，如人教版只是簡單地說明了實驗的結論，蘇教版只以“知識海洋”的方式做了簡介，浙科版對這一實驗的著墨相對較多，但也基本沒有提及具體的操作過程。②與生物學教學相關的雜志中，這方面的相關論文也極少，在中國知網上以煙草花葉病毒為關鍵詞，以生物學通報為文獻來源進行檢索，只搜到3篇論文。下面以浙科版教材為例，對學生經常產生的三個疑惑點進行探析。

1使煙草花葉病毒感染煙草的操作方法

1.1疑惑：如何進行煙草花葉病毒感染煙草的操作

在浙科版高中生物學教材中多次提及“感染”操作，如“用RNA和蛋白質分別去感染煙草”“分別來自不同病毒株系的RNA和蛋白質混合后感染煙草”等。但教材中并未提及“感染”的具體操作方法，在其他章節中也未出現可供參考的內容，這讓許多學生對此中產生疑惑。

1.2解析：感染操作采用常規的摩擦接種法

煙草花葉病毒有很多類型，不同類型的侵染方式不同。它們都無特殊的吸附結構，故只能以被動方式侵入，如借助于昆蟲的刺吸式口器或植物天然傷口侵入。其中，TMV可通過相鄰葉片摩擦形成的輕微傷口入侵。在自然條件下。被煙草花葉病毒侵染后的種子、葉片等是主要侵染源。煙株發生感染的主要時期是苗期至現蕾期，此時煙株抵抗煙草花葉病的能力弱，易感病。在本實驗中，使煙草花葉病毒感染煙草的常規方法是摩擦接種。具體的操作是選取生長期、長勢相同的煙草若干，在葉片表面噴灑金剛砂，用刷子蘸取病毒液輕輕摩擦，重復幾次。接種后，需用清水輕輕沖洗葉片葉面，以利于植株發病。由于TMV發病最適溫度為25～27°C，當溫度高于38℃后，病毒會受到高溫的抑制，因此實驗應在20～30°溫室內進行。

2將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質相互分離的操作方法

2.1疑惑：如何人為地將煙草花葉病毒的RNA與蛋白質相互分離

浙科版教材在“煙草花葉病毒（a、b）及其對葉子細胞的感染和病毒重建（c）”示意圖中標出，通過“降解”的方法將TMV的RNA與蛋白質相互分離，但沒有寫明其降解的具體方法。受酶解法除去植物細胞的細胞壁等知識的影響，多數學生錯誤地認為在該實驗中也是用酶解法進行“降解”的。

2.2解析：用石碳酸處理或堿性洗滌劑處理。可使煙草花葉病毒的RNA與蛋白質相互分離

格勒（Gierer）和施拉姆（Schramm）在進行煙草花葉病毒的感染實驗時，采用了將TMV放入水和苯酚（石碳酸）中震蕩的方法，將蛋白質和RNA分離（圖1）。其基本操作是將TMV溶液與苯酚的水溶液混合，配制調成質量分數為3%的十二烷基硫酸鈉（SDS）和物質量濃度為0.3 mol/L NaAc的混合溶液。在4°C下劇烈振蕩溶液，離心后取水相，可得到TMV的RNA。

美國加利福尼亞大學的弗倫克爾·康拉特（H.F.Conrat）和威廉姆斯（R.C.Williams）在進行煙草花葉病毒的重建實驗時，采用先將TMV用弱堿性洗滌劑處理，然后通過分別提純的方法將TMV的RNA和蛋白質分離。其基本的操作是在3℃條件下，將TMV溶液置于pH為10～10.5的甘氨酸緩沖液或pH為10.5的碳酸氫鹽中透析48～72 h。用冷超速離心法分離除去未降解的病毒，用硫酸銨將上清液調至pH為0.4的飽和液，并再次離心。離心后，TMV的蛋白質主要存在于沉淀中，而RNA主要存在于上清液中。對蛋白質部分進行重新溶解，經在低硫酸銨濃度下沉淀、透析等操作后，可獲得純度高、重組效果好的TMV的蛋白質。

從經堿降解的TMV中提取的核酸組分，其重組效果不如用洗滌劑法提取的核酸組分。洗滌劑法提取核酸的基本操作是將含有SDS質量濃度為1%的病毒溶液的pH調整為8.5，并在40℃下保持16～20 h。用硫酸銨使蛋白質沉淀后，取上清液。將上清液冷藏、離心，并用冷乙醇和pH為5的乙酸鹽進一步純化，可獲得重建效果好的TMV的RNA。

3將提純后的RNA和蛋白質體外重建的操作方法

3.1疑惑：如何實現煙草花葉病毒的體外重建

在浙科版教材中，關于煙草花葉病毒重建操作的相關表述只有一句：“來自不同病毒株系的RNA和蛋白質混合后感染煙草”。至于RNA和蛋白質應該在什么樣的環境進行混合，混合后又應置于什么樣的環境下等問題都沒有說明。這就容易導致學生簡單地認為，只要病毒的核酸和蛋白質在細胞外相遇，就可以自發的重建，不需要特殊處理。

3.2解析：體外重建效果受pH和離子強度等因素的影響

TMV結構簡單，是一種典型的棒狀植物病毒，約由2 130個相同的蛋白亞基沿著單鏈RNA螺旋狀而成，有較強的自組裝特性。體外重建的效果受pH和離子強度等因素的影響。弗倫克爾·康拉特和威廉姆斯在進行重建活性病毒時的基本操作是將質量分數為1%的蛋白質溶液與質量分數為0.1%的核酸溶液按一定比例混合，并添加適當的緩沖液，使樣品呈現乳白色。pH為6的醋酸鹽作為緩沖劑的效果最好，但磷酸鹽（pH為6.3或7.0）和乙酸銨（pH為6）也可使用。將樣品置于3℃環境下保存24 h后，進行超速離心，除去不可溶物質，獲得乳白色上清液，即可從乳白色上清液中獲得有活性的重組病毒。用電子顯微鏡觀察，發現在重建過程中最初形成的是圓盤狀、帶有中心孔的蛋白質聚集體（圖2），最終形成的重組煙草花葉病毒的形態與正常TMV相同，但短片段比例較大（圖3）。

由于受到課程的性質、文本的篇幅等因素的限制，高中生物學教材不可能對各種生物學知識都加以詳盡的介紹。學生在學習的過程中也難免會出現一些困惑。在學生產生困惑之后，教師應積極地引導學生去解決困惑。解決困惑的有效方法之一是查閱科學家最初發表的相關研究論文。