基于PCR及電泳技術(shù)，開(kāi)展高中生物研究性學(xué)習(xí)

劉淑仙 吳春萍

摘要：以“利用DNA條形碼調(diào)查校園昆蟲(chóng)多樣性”課題為例，敘述了如何利用PCR及電泳技術(shù)開(kāi)展高中生物研究性學(xué)習(xí)的具體實(shí)施方案。

關(guān)鍵詞：DNA提取 PCR擴(kuò)增 電泳 研究性學(xué)習(xí)

中圖分類號(hào)：G633.91 文獻(xiàn)標(biāo)志碼：A

研究性學(xué)習(xí)是指在教師的指導(dǎo)下，由學(xué)生從學(xué)習(xí)生活和社會(huì)生活情境中發(fā)現(xiàn)問(wèn)題，選取課題，設(shè)計(jì)研究方案，通過(guò)主動(dòng)的探索和研究，最終實(shí)現(xiàn)問(wèn)題解決的學(xué)習(xí)過(guò)程。在高中階段開(kāi)展研究性學(xué)習(xí)是非常必要的。首先，研究性學(xué)習(xí)從根本上改變了過(guò)去傳統(tǒng)的教學(xué)模式，真正做到以學(xué)生為主體：使學(xué)生在知識(shí)層面實(shí)現(xiàn)拓展與遷移;在過(guò)程上，增強(qiáng)了實(shí)踐能力：在能力上提升了創(chuàng)新力，在情感上，增強(qiáng)了團(tuán)隊(duì)合作意識(shí)，在目標(biāo)達(dá)成上提高了生物學(xué)學(xué)科核心素養(yǎng)。其次，研究性學(xué)習(xí)給教師的教學(xué)方式提出了新的要求。在教學(xué)過(guò)程中，教師不再是講授者和演示者，而是學(xué)生的組織者、合作者、鼓勵(lì)者和引導(dǎo)者?！镀胀ǜ咧猩飳W(xué)課程標(biāo)準(zhǔn)（2017年版）》（以下簡(jiǎn)稱《新課標(biāo)》）中提出“高中生物學(xué)課程要求讓學(xué)生領(lǐng)悟生物學(xué)家在研究過(guò)程中所持有的觀點(diǎn)以及解決問(wèn)題的思路和方法，要求學(xué)生主動(dòng)地參與學(xué)習(xí)，在親歷提出問(wèn)題、獲取信息、尋找證據(jù)、檢驗(yàn)假設(shè)、發(fā)現(xiàn)規(guī)律等過(guò)程中習(xí)得生物學(xué)知識(shí)，養(yǎng)成科學(xué)思維的習(xí)慣，形成積極的科學(xué)態(tài)度，發(fā)展終身學(xué)習(xí)及創(chuàng)新實(shí)踐能力”。因此，研究性學(xué)習(xí)是適應(yīng)《新課標(biāo)》理念的良好教學(xué)方式。

多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）是一種體外迅速擴(kuò)增DNA片段的技術(shù)，它能以極少的DNA為模板在幾小時(shí)內(nèi)復(fù)制出上百萬(wàn)份的DNA拷貝。PCR實(shí)驗(yàn)教學(xué)是高中生物教學(xué)的重要組成部分?！缎抡n標(biāo)》提出“為幫助學(xué)生達(dá)成對(duì)選擇性必修課程概念5的理解，促進(jìn)學(xué)生生物學(xué)科核心素養(yǎng)的提升，應(yīng)開(kāi)展利用PCR擴(kuò)增DNA片段并完成電泳鑒定教學(xué)活動(dòng)”。PCR技術(shù)在科學(xué)研究領(lǐng)域應(yīng)用非常廣泛，如PCR技術(shù)可以獲取目的基因用于基因工程，用于動(dòng)植物、微生物及病毒的物種鑒定、遺傳疾病的診斷、刑偵破案等。另外，基于科研論文的北京高考以及各區(qū)模擬試題中多有考查，因此，在高中階段開(kāi)展基于PCR技術(shù)的研究性學(xué)習(xí)是十分必要的。

電泳是指帶電粒子在電場(chǎng)作用下發(fā)生遷移的過(guò)程。DNA分子帶有負(fù)電，因此，在電場(chǎng)的作用下，DNA分子會(huì)向著與其所帶電荷相反的電極移動(dòng)。利用DNA樣品分子本身的大小，使帶電分子產(chǎn)生不同的遷移速度，從而實(shí)現(xiàn)不同大小DNA分子的分離。下面利用瓊脂糖凝膠電泳技術(shù)對(duì)PCR擴(kuò)增成功與否進(jìn)行鑒定。

1課程安排

本課以校本課程為平臺(tái)，面向高一、高二學(xué)生開(kāi)設(shè)。每學(xué)期初，學(xué)生根據(jù)興趣選擇課程。學(xué)生一般控制15人左右，課程實(shí)施時(shí)間為每周三和周四下午4：30-5：30。每學(xué)期18周，共36課時(shí)。

2教學(xué)實(shí)施過(guò)程

2.1理論學(xué)習(xí)先行

筆者利用5課時(shí)講授相關(guān)基礎(chǔ)知識(shí)，內(nèi)容見(jiàn)表1。

2.2成，AN究性學(xué)習(xí)小組

研究性學(xué)習(xí)的組織形式采用小組合作研究，每組2-4人不等。學(xué)生自愿成組，在此形式下，學(xué)生可以相互啟發(fā)，碰撞出更多的思維火花。另外，學(xué)生的合作精神也得到提高，學(xué)生可以學(xué)會(huì)交往、學(xué)會(huì)合作、學(xué)會(huì)尊重、學(xué)會(huì)理解他人的情感和意識(shí)。

2.3選定可操作性課題

研究性學(xué)習(xí)的開(kāi)展，選題非常重要。切合實(shí)際、可操作性強(qiáng)的選題是成功的一半。在教學(xué)實(shí)施過(guò)程中，每個(gè)研究性小組組內(nèi)成員可依據(jù)日常生活中的常見(jiàn)問(wèn)題，討論選定自己感興趣的課題，最終通過(guò)師生共同討論，擯棄不可操作的課題，選定可操作性的課題。筆者近幾年開(kāi)展了如下幾個(gè)課題，分別是：利用DNA條形碼調(diào)查校園昆蟲(chóng)多樣性;探究不同種類水果中寄生果蠅的種類;利用DNA條形碼鑒別市場(chǎng)上的真假羊肉等。下面以“利用DNA條形碼調(diào)查校園昆蟲(chóng)多樣性”課題為例進(jìn)行詳細(xì)介紹。

2.4樣品采集

學(xué)生在校園內(nèi)用捕蟲(chóng)網(wǎng)、掃網(wǎng)捕捉等采集昆蟲(chóng)。然后，將昆蟲(chóng)浸泡在無(wú)水乙醇中，或者放入加有乙酸乙酯的毒瓶中，帶到實(shí)驗(yàn)室備用。采集標(biāo)本后，學(xué)生要查閱文獻(xiàn)、書(shū)籍等資料認(rèn)識(shí)所采集的昆蟲(chóng)，可以借助學(xué)校圖書(shū)館，例如《中國(guó)動(dòng)物志》《普通昆蟲(chóng)學(xué)》等，也可以借助網(wǎng)絡(luò)資源，如中國(guó)知網(wǎng)、萬(wàn)方數(shù)據(jù)等，學(xué)習(xí)相關(guān)昆蟲(chóng)知識(shí)和研究背景，做好摘錄。

2.5開(kāi)展實(shí)驗(yàn)

2.5.1材料用具

主要實(shí)驗(yàn)器材：移液槍、電熱恒溫水浴鍋、高速離心機(jī)、PCR擴(kuò)增儀、電子天平、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀、凝膠成像儀、滅菌鍋、1.5 mL離心管、0.2 mL的PCR管、樣品冷凍盒。

主要實(shí)驗(yàn)試劑：（1）總DNA提?。菏褂肊zup柱式植物（動(dòng)物）基因組DNA抽提試劑盒。（2）PCR相關(guān)試劑：DNA聚合酶（Takara）以及配套dNTP，10xPCR Buf-fer或者Easy Taq DNA聚合酶以及配套dNTP，10xBubfer，去離子水（ddH20），己合成的PCR引物。（3）電泳檢測(cè)：瓊脂糖，TAE電泳緩沖液（Tris醋酸40 mM，EDTA 2 raM）。核酸染料最好購(gòu)買(mǎi)溴化乙錠（EB）的替代品，毒性小，以確保實(shí)驗(yàn)安全。

2.5.2總DNA提取

DNA提取方法使用DNA抽提試劑盒。DNA提取的步驟在試劑盒說(shuō)明書(shū)的基礎(chǔ)上做略微調(diào)整。主要調(diào)整步驟為：①生物組織的研磨方法，由于高中生物實(shí)驗(yàn)室沒(méi)有組織研磨器，因此，將藍(lán)色槍頭在酒精燈上灼燒成一個(gè)圓頭，待其冷卻作為研磨頭，將組織放入1.5 mL離心管中，進(jìn)行手動(dòng)研磨。②按照DNA提取試劑盒步驟加入緩沖液和蛋白酶K進(jìn)行消化，消化時(shí)間根據(jù)組織的大小有所調(diào)整，一般在2～3 h之間。

2.5.3 PCR擴(kuò)增

PCR擴(kuò)增建議選用線粒體中的細(xì)胞色素C氧化酶亞基I（COI）基因片段。該基因引物比較成熟，擴(kuò)增成功率高。大多數(shù)的動(dòng)物樣品均可以使用通用引物L(fēng)C01490和HC02198進(jìn)行常規(guī)PCR擴(kuò)增。正向引物序列LC01490 5-GGTCAACAAATCATAAAGATATYGG-3，反向引物序列HC02198 5-TAAACTFCAGGGTGACCAAAAAATCA-3。PCR反應(yīng)體系按照表2的各成分順序加入PCR管中，需要注意的是最后加入Taq酶（-20°C保存），現(xiàn)加現(xiàn)取，加完后立即放回冰箱。每次加完一種成分需要更換槍頭，以免造成樣品污染。將所有樣品加入PCR管后，用移液槍上下吸打混勻反應(yīng)液，放入PCR擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增。

設(shè)置PCR儀的反應(yīng)條件為：94。C預(yù)變性2mini 35個(gè)循環(huán)（94°C變性30 s，45～58°C退火1 min，72°C延伸1 min），72°c終延伸10 min。其中退火溫度設(shè)定比較關(guān)鍵，可以按照引物Tm值的不同，設(shè)定不同的退火溫度。退火溫度越高，PCR擴(kuò)增的特異性越好，成功率越低;退火溫度越低，PCR擴(kuò)增的成功率越高，但是特異性越差。用上述通用引物PCR擴(kuò)增昆蟲(chóng)和羊肉的COI片段，選擇53°C退火溫度，擴(kuò)增成功率很高。

2.5.4電泳檢測(cè)

PCR是否成功使用質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1%的瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，具體操作如下。

①制膠：取0.2 g瓊脂糖，放入250 mL的錐形瓶中，加入20 mL的1xTAE緩沖液混勻，將錐形瓶放入微波爐，加熱溶解1min，待溫度降至50～65°C左右（以手觸可以承受）之后加入2uL核酸染料，倒入插有梳子的制膠板上備用。

②點(diǎn)樣：室溫下，待凝膠完全凝固后，拔出梳齒，將膠板放入電泳槽中。注意點(diǎn)樣孔應(yīng)在電泳槽負(fù)極一側(cè)，因?yàn)镈NA帶有負(fù)電荷，移動(dòng)方向由負(fù)極移向正極。在電泳槽中加入lxTAE緩沖液，以高出凝膠表面2mm為宜。取5uL產(chǎn)物，混入約1uL的Loadingbur-fer（電泳指示劑）染色，上樣于點(diǎn)樣孔中，注意加樣器吸頭應(yīng)恰好置于凝膠點(diǎn)樣孔中，不可刺穿凝膠，也要防止將樣品溢出孔外。

③電泳：接通電源，打開(kāi)穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀，設(shè)置參數(shù)為穩(wěn)壓120V，穩(wěn)流電泳400 mA，電泳時(shí)間20 min。點(diǎn)擊啟動(dòng)按鈕。

④結(jié)果觀察：電泳結(jié)果在凝膠成像儀（紫外燈下）中觀察。

在電泳過(guò)程中，教師一定要做好實(shí)驗(yàn)安全教育工作。雖然，本實(shí)驗(yàn)購(gòu)買(mǎi)的核酸染料是適用于高中生的低毒試劑。但是仍然要嚴(yán)格要求學(xué)生帶手套操作，強(qiáng)化安全教育，增強(qiáng)學(xué)生自我保護(hù)意識(shí)。同時(shí)，電泳后的瓊脂糖凝膠需丟入實(shí)驗(yàn)廢棄物垃圾箱，使學(xué)生形成實(shí)驗(yàn)廢棄物要妥善處理的意識(shí)。

點(diǎn)樣孔1的DNA Marker是由5條線狀雙鏈DNA條帶組成，用于判斷電泳中DNA條帶長(zhǎng)度的標(biāo)準(zhǔn)。圖1中電泳圖2、3、4、7點(diǎn)樣孔條帶長(zhǎng)度大約是750 bp。與所要擴(kuò)增的COI目的片段長(zhǎng)度相符，初步可以判斷這幾個(gè)PCR樣品擴(kuò)增成功。5、6、8點(diǎn)樣孔擴(kuò)增失敗。將擴(kuò)增成功的PCR原液送生物公司測(cè)序。

2.5.5DNA序列分析

通過(guò)Seqman 5.01（DNASTAR，Inc.1996）進(jìn)行雙向測(cè)序結(jié)果的拼接。利用美國(guó)國(guó)立生物技術(shù)信息中心NCBI（National Center for Biotechnology Informa-tion）、中國(guó)DNA條形碼數(shù)據(jù)庫(kù)等網(wǎng)上DNA序列數(shù)據(jù)庫(kù)資源，進(jìn)行序列比對(duì)從而達(dá)到物種鑒定的目的?；?qū)CBI中的相似性最高的序列下載下來(lái)，用軟件MEGA 5.0中的Clustal W與待測(cè)樣本DNA進(jìn)行序列比對(duì)。此部分對(duì)于高中生來(lái)說(shuō)較難操作，需要教師在課上指導(dǎo)完成，一般需要2周，共4課時(shí)。

2.6結(jié)果與分析

本研究通過(guò)將測(cè)序結(jié)果與NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中己知物種的COI序列比對(duì)分析相似度高達(dá)99%以上。最終，鑒定出校園中7種昆蟲(chóng)（表2）。其余個(gè)體未在NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中找到同種序列，但有近緣種，需要通過(guò)昆蟲(chóng)外部形態(tài)鑒定方法確定其分類地位，這也將是后續(xù)研究性學(xué)習(xí)要拓展的內(nèi)容。

2.7撰寫(xiě)研究論文

每個(gè)研究小組的成果最終以研究論文的形式體現(xiàn)。教師用1課時(shí)講授研究論文的書(shū)寫(xiě)內(nèi)容、格式等要求，包括研究題目、摘要：、關(guān)鍵詞：、研究背景、研究方法、結(jié)果與討論、參考文獻(xiàn)。學(xué)生按照書(shū)寫(xiě)要求撰寫(xiě)研究論文。此過(guò)程需要學(xué)生利用課上和課下時(shí)間綜合完成，一般需要2周，共4課時(shí)。

2.8結(jié)題匯報(bào)

在課程最后一周的2課時(shí)，每個(gè)小組進(jìn)行研究性學(xué)習(xí)結(jié)題匯報(bào)，作為本次課程的升華，匯報(bào)可以采用答辯會(huì)的方式，由學(xué)生和教師共同評(píng)價(jià)。此方式可以使各小組的科學(xué)研究的方法和成果在全體同學(xué)中交流推廣，也激發(fā)了學(xué)生參與研究性學(xué)習(xí)的積極性和主動(dòng)性。

3教學(xué)心得和感悟

PCR擴(kuò)增和電泳技術(shù)屬于現(xiàn)代分子生物學(xué)技術(shù)。如果教師只靠課堂上的理論講解，學(xué)生很難深刻理解其含義。而通過(guò)研究性學(xué)習(xí)可以讓學(xué)生充分理解這兩項(xiàng)技術(shù)的基本原理和應(yīng)用;本研究從分子水平分析不同物種的差異，讓學(xué)生領(lǐng)悟到物種外部形態(tài)的差異源于其DNA分子的差異，從而建立個(gè)體水平和分子水平的聯(lián)系。

在研究過(guò)程中，學(xué)生尊重實(shí)驗(yàn)和證據(jù)，運(yùn)用科學(xué)的思維方法解決實(shí)際問(wèn)題，如掌握了科學(xué)分析電泳圖譜的能力。學(xué)生從身邊昆蟲(chóng)入手，在探究過(guò)程中，逐步增強(qiáng)對(duì)自然現(xiàn)象的好奇心和求知欲，并且在研究中，樂(lè)于并善于團(tuán)隊(duì)合作，勇于創(chuàng)新，提升了科學(xué)探究的核心素養(yǎng)。學(xué)生鑒定出校園中存在多種多樣的昆蟲(chóng)，進(jìn)一步了解昆蟲(chóng)與周圍環(huán)境的關(guān)系，認(rèn)識(shí)到保護(hù)生物多樣性的重要性，最終形成生態(tài)意識(shí)，自覺(jué)參與環(huán)境保護(hù)實(shí)踐。