新診斷膠質瘤MGMT基因啟動子甲基化水平定量分析

張國臣 常玉喜 韓 磊 徐 欣 趙 明 陳忠平

O6-甲基鳥嘌呤-DNA 甲基轉移酶（O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT）可以修復烷化劑對染色體的致癌、致突變和細胞毒作用的損傷。在正常情況下，MGMT對細胞起保護作用，但是在膠質瘤的化療過程中，MGMT 可以修復化療藥物對膠質瘤細胞產生的殺傷，從而降低化療療效[1]。MGMT 基因啟動子甲基化（簡稱MGMT 甲基化）可以降低MGMT的表達。本文定量分析新診斷膠質瘤MGMT甲基化水平，為臨床診治提供參考。

1 資料和方法

1.1 標本來源 收集鄭州大學附屬腫瘤醫院神經外科2016年1月至2019年6月手術切除并經病理診斷為膠質瘤標本225例，其中男116例，女109例；平均年齡（48.71±14.82）歲；少突膠質細胞瘤50 例（WHO分級Ⅱ級36 例，Ⅲ級14 例），星形細胞瘤109 例（WHO分級Ⅰ級4例，Ⅱ級58例，Ⅲ級47例），少突星形細胞瘤9 例（WHO 分級Ⅱ級），膠質母細胞瘤（WHO分級Ⅳ級）57例。

1.2 入組標準 經手術病理證實為膠質瘤；新診斷初治膠質瘤；腫瘤組織行MGMT甲基化水平檢測。

1.3 排除標準 術后病理證實為非膠質瘤；既往經過放、化療等治療的復發膠質瘤；腫瘤組織未行MGMT甲基化水平檢測。

1.4 MGMT 的檢測 采用焦磷酸測序儀（美國QIAGEN 公司，Qiagen PyroMark Q24），嚴格按照Human MGMT Gene methylation Detection Kit 試劑盒（美國QIAGEN公司）說明書進行測序。采用TIANamp FFPE DNA Kit 提取DNA，DNA 濃度為20 ng/μl，OD 260/280 為1.82，檢測靈敏度為1%（10 ng/μl DNA），引物類型為YGAYGTTYGTAGGTTTTYGT。標本類型為石蠟塊。結果判讀：選擇MGMT 基因啟動子區甲基化水平最高的4 個CpG 位點，將各位點的甲基化水平以百分率的形式作為定量數據，取4 個位點的平均值作為最終MGMT甲基化水平。

1.5 判斷標準 健康人群血液平均檢測值：MGMT 甲基化水平≤4%。膠質瘤平均檢測值：MGMT 甲基化水平≥8%為陽性，否則判為陰性，其中MGMT甲基化水平≥40%病人，替莫唑胺化療總生存期明顯延長[2]。1.6 統計學方法 利用SPSS 19.0軟件處理，計量資料以±s表示，采用t檢驗和單因素方差分析；計數資料采用χ2檢驗；采用Pearson 相關系數或Spearman秩相關系數分析相關性；P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

新診斷膠質瘤MGMT基因啟動子甲基化水平為（23.68±14.88）%，陽性率為89.33%。≥40 歲病人MGMT 甲基化水平明顯高于＜40 歲病人（P＜0.05，表1），少突膠質細胞瘤MGMT 甲基化水平較星形細胞瘤、少突星形細胞瘤、膠質母細胞瘤均明顯增高（P＜0.05，表1）。而不同性別、不同WHO 分級病人MGMT甲基化水平均無明顯差異（P＞0.05，表1）。膠質瘤MGMT 甲基化水平與病人年齡呈正相關（r=0.135，P＜0.05），而與病人性別和腫瘤WHO 級別無明顯關系（P＞0.05）。

3 討論

MGMT既能修復外界不良因素對正常細胞造成的損害，也可修復化療藥物對腫瘤細胞造成的殺傷。影響MGMT 表達的因素很多。Ovchinnikov 等[3]證實，MGMT基因啟動子CpG島處于甲基化狀態，可導致MGMT 基因停止轉錄，從而減少MGMT 的表達。另外，趙宇航等[4]發現膠質瘤細胞MGMT 甲基化、IDH1 突變、P53 和TERT 突變之間存在復雜的相互調節作用。目前認為，MGMT 甲基化是膠質瘤病人預后良好的獨立預測因素之一[5]，檢測膠質瘤細胞MGMT甲基化可以預測烷化劑等化療藥物的效果[6]。

對于MGMT 甲基化檢測方法，起初多采用免疫組織化學法，并將其分為陰性（-）、弱陽性或可疑陽性（+/-）、陽性（+）、中等陽性（++）、強陽性（+++），間接說明MGMT甲基化程度[7]，并用于指導膠質瘤化療方案的選擇[8]；但是該方法為MGMT 的定性分析，結果受主觀因素影響較大，且表達量的多少容易受到電離輻射、糖皮質激素等的影響，并不能精確地指導化療。隨著分子生物學技術的發展，Pulling等[9]利用甲基化特異性聚合酶鏈反應檢測MGMT 甲基化水平，并與既往免疫組織化學法結果相比較，兩者符合率達83%，但沒有研究MGMT 甲基化的程度。對于MGMT甲基化陽性病例，因MGMT活性有強弱之分，對化療藥物的殺傷修復能力也一定有差別，化療藥物效果也勢必不同，因此，單純定性分析MGMT甲基化，并不能很好地指導化療。

表1 新診斷膠質瘤MGMT基因啟動子甲基化水平量化分析結果

我們采用焦磷酸測序檢測方法，選擇MGMT 基因啟動子甲基化水平最高的四個CpG 位點，將甲基化水平以百分率的形式表示，取四個位點的平均值進行量化分析MGMT 甲基化水平。按照本文標準，本文病人MGMT 甲基化陽性率為89.33%，且不受性別、年齡、腫瘤類型、腫瘤級別的影響，與文獻[10]報道基本相符。雖然MGMT 甲基化陽性率較高，但是膠質瘤病人預后并不好，本文發現MGMT 甲基化水平≥40%的病人僅占11.11%，可能調高MGMT 甲基化陽性標準更符合臨床實際。黃磊等[11]報道，MGMT水平與年齡呈負相關，且男性MGMT mRNA 含量較女性高。本文MGMT 甲基化水平與病人年齡正相關，年齡越大MGMT甲基化水平越高（P＜0.05），但是不同性別之間并無明顯差異（P＞0.05），與上述文獻不全相符。另外，我們還發現，不同病理類型膠質瘤MGMT 甲基化水平也有差異，少突膠質細胞瘤MGMT 甲基化水平明顯高于星形細胞瘤（P＜0.05），與文獻[12]報道相符，這可能也是少突膠質細胞瘤病人放、化療效果較好的原因之一。唐天友等[13]認為，MGMT 甲基化水平越高，膠質瘤級別越高。陳功等[14]認為高級別膠質瘤MGMT甲基化水平低于低級別膠質瘤，并認為其是高級別膠質瘤預后較差的因素之一。本文結果顯示，MGMT 甲基化水平與膠質瘤級別均無明顯關系（P＞0.05），與文獻報道不同，實際情況有待進一步研究驗證。總之，新診斷膠質瘤MGMT 甲基化水平與病人與年齡正相關，少突膠質細胞瘤MGMT 甲基化水平明顯高于其他類型膠質瘤。