不同呼吸道拭子保存液對(duì)核酸檢測(cè)結(jié)果的影響比較*

鄭州大學(xué)附屬兒童醫(yī)院（河南 鄭州 450000）

李曉燕 靳秀紅 楊俊梅

呼吸道疾病在世界范圍內(nèi)都是危害人類健康的重要因素，能夠引起患者多種癥狀且傳染性強(qiáng)[1-2]。目前針對(duì)呼吸道病原核酸的分子生物學(xué)檢測(cè)如PCR、基因芯片等檢測(cè)方法發(fā)展迅速，因其靈敏度高、特異性好的特點(diǎn)成為呼吸道病原檢測(cè)的重要方法[1，3]。

目前呼吸道病原核酸檢測(cè)主要的樣本類型是咽拭子，常用的拭子樣本采樣保存液為病毒轉(zhuǎn)運(yùn)培養(yǎng)基，這種采樣保存液采集后的標(biāo)本都需要冷藏或冷凍運(yùn)輸儲(chǔ)存；而核酸樣本容易降解，樣本的采集轉(zhuǎn)運(yùn)過(guò)程中很難保證全程低溫，樣本檢測(cè)前質(zhì)量控制較難保 證[4-8]。我們對(duì)一種新型可常溫保存呼吸道拭子的保存液與常規(guī)的保存液進(jìn)行了對(duì)比評(píng)估研究，以評(píng)價(jià)樣本保存效果。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)對(duì)象 臨床樣本為鄭州兒童醫(yī)院2018年6月～2018年12月呼吸道感染住院兒童患者427例，年齡為 1個(gè)月到13歲，其中男性198例，女性229例，臨床診斷主要為上呼吸道感染、扁桃體炎、支氣管炎、肺炎等。

1.2 試劑和儀器 一次性使用樣本保存液(以下簡(jiǎn)稱康健拭子保存液)購(gòu)自江蘇康健醫(yī)療用品有限公司、新型的拭子樣本常溫保存液(以下簡(jiǎn)稱新型拭子保存液)由鄭州安圖生物工程股份有限公司提供；呼吸道合胞病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?、甲型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒(PCR-熒光探針?lè)?購(gòu)自中山大學(xué)達(dá)安基因股份有限公司，病毒基因組DNA/RNA提取試劑盒購(gòu)買自天根生化科技(北京)有限公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀為ABI7500熒光定量PCR儀。

1.3 方法

1.3.1 樣本采集和檢測(cè)：對(duì)同一患者，用無(wú)菌的植絨性拭子采集兩根咽部分泌物，先后采集兩根，交替方式洗脫到兩種不同保存液中。考慮臨床檢測(cè)實(shí)際需求，標(biāo)本運(yùn)輸?shù)降谌綄?shí)驗(yàn)室需要2～3天，依照采樣液說(shuō)明書(shū)，康健拭子保存液洗脫樣本暫放置至4℃冰箱當(dāng)天檢測(cè)，新型拭子保存液洗脫樣本放置至室溫3天后檢測(cè)，用呼吸道合胞病毒核酸檢測(cè)試劑盒、甲型流感病毒核酸檢測(cè)試劑盒對(duì)標(biāo)本進(jìn)行QPCR檢測(cè)。

1.3.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析：應(yīng)用SPSS11.0軟件創(chuàng)建數(shù)據(jù)庫(kù)，并采取R×C(χ2)檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 兩種拭子保存液樣本檢測(cè)結(jié)果 427例呼吸道臨床患者中，用康健拭子保存液洗脫樣本保存當(dāng)天檢測(cè)，檢測(cè)出甲型流感病毒105例，陽(yáng)性率24.59%，檢測(cè)出呼吸道合胞病毒47例，陽(yáng)性檢出率11.01%；用新型拭子保存液洗脫樣本室溫保存3天后進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)出甲型流感病毒104例，陽(yáng)性率24.36%，檢測(cè)出呼吸道合胞病毒46例，陽(yáng)性檢出率10.77%。

2.2 對(duì)兩種保存液保存的拭子檢測(cè)結(jié)果 進(jìn)行卡方檢驗(yàn)，甲型流感病毒檢測(cè)率無(wú)顯著性差異(χ2＝0.20，P＞0.05)呼吸道合胞病毒檢出率無(wú)無(wú)顯著性差異(χ2＝0.33，P＞0.05)。對(duì)兩種拭子保存液保存樣本檢測(cè)結(jié)果如表1和表2。

3 討 論

兒童急性呼吸道感染病毒病原診斷通常采用呼吸道標(biāo)本，上呼吸道標(biāo)本主要包括口咽拭子、鼻咽拭子(nasopharyngeal swab，NPS)、鼻咽吸取物(nasopharyngeal aspirates，NPA)；上呼吸道標(biāo)本，尤其易干燥的病毒樣本(如咽拭子)必須采用病毒運(yùn)輸液(virus transport medium，VTM)或其他相應(yīng)的緩沖液保存樣本，以維持病毒的穩(wěn)定。送檢標(biāo)本中病毒活性會(huì)隨時(shí)間延長(zhǎng)而降低，標(biāo)本采集后應(yīng)盡快送檢。呼吸道標(biāo)本應(yīng)在室溫下30min內(nèi)送檢，4℃可在2～4h內(nèi)送檢，來(lái)不及處理的標(biāo)本4℃保存不應(yīng)超過(guò)48h。隨著國(guó)內(nèi)第三方檢驗(yàn)機(jī)構(gòu)和區(qū)域檢驗(yàn)中心的發(fā)展，標(biāo)本往往需要寄送到其它實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行檢測(cè)。現(xiàn)有的VTM運(yùn)輸液，要求標(biāo)本運(yùn)輸過(guò)程中保持低溫，需要添加冰袋等制冷劑，極大增加了運(yùn)輸成本。同時(shí)因運(yùn)輸距離遠(yuǎn)近不同，運(yùn)輸時(shí)間長(zhǎng)短不一，很難保證運(yùn)輸過(guò)程中全程維持低溫。

本研究中的新型保存液，可實(shí)現(xiàn)核酸標(biāo)本的常溫運(yùn)輸，經(jīng)427例臨床標(biāo)本驗(yàn)證，樣本保存穩(wěn)定性與VTM冷藏保存的效果一致，極大提供了臨床使用的便捷性。

本研究中，甲型流感病毒有5例不一致，合胞病毒有3例不一致，經(jīng)重復(fù)檢測(cè)，均屬于試劑盒檢測(cè)限附近樣本，結(jié)果變異較大，后續(xù)需加大考核數(shù)量。

本研究中的新型保存液，試劑主要組分為異硫氰酸胍等化學(xué)試劑，異硫氰酸胍是一種蛋白裂解劑，在分子診斷試劑中常作為裂解液主要組分，新型保存液同時(shí)具備預(yù)裂解功能，樣本采集后就開(kāi)始了病毒的裂解，一定程度上減少了呼吸道標(biāo)本在運(yùn)輸和檢測(cè)過(guò)程中的生物安全性危害。同時(shí)新型保存液從原理上不適用于病毒的分離培養(yǎng)和抗原的檢測(cè)，只能專配分子診斷試劑檢測(cè)應(yīng)用。

表1 427例呼吸道患者甲型流感病毒兩種拭子保存液檢測(cè)情況(n=427)

表2 427例呼吸道患者呼吸道合胞病毒2種拭子保存液檢測(cè)情況(n=427)