膠滴腫瘤藥敏檢測技術評價卡培他濱對胃癌體外藥敏實驗的條件探索

智慧芳，李春鳳，賈玉霞，趙九娥，倪君君

北京和合醫學診斷技術股份有限公司中心實驗室，北京100011

近年來早期診斷和外科手術技術的發展，為癌癥患者帶來了希望。然而，胃癌作為中國發病率和病死率均較高的惡性腫瘤之一，復發率和轉移率也較高，所以術后輔助化療仍然是胃癌綜合治療的重要組成部分[1-2]。由于腫瘤的異質性，即使同一化療方案，不同患者產生的療效也差異顯著，因此，選擇適合個體的化療藥物，既可提高療效避免不必要的不良反應，同時也可減輕患者的經濟負擔[3]。膠滴腫瘤藥敏檢測技術（collagen gel droplet embedded culture drug sensitivity test，CD-DST）是利用膠原凝膠在37℃時形成三維立體結構的特點，將腫瘤細胞包埋于膠滴中，模擬體內實體腫瘤細胞生長的微環境，從而在相似的生長環境中評價化療藥物的有效率。CD-DST具有原代細胞培養成功率高、所需細胞量少、檢測藥物種類多等優點，使腫瘤個體化治療成為可能[4-5]。該技術在腫瘤體外藥敏檢測中的應用研究已有十余年的歷史。卡培他濱（capecitabine，CAP）作為5-氟尿嘧啶（5-fluorouracil，5-FU）的前體藥物，也是胃癌輔助化療的常用藥，由于其不良反應小，療效顯著，已被廣泛應用于臨床。相較于其他抗腫瘤藥物，CAP具有更好的安全性和有效性[6]。但截至目前未有研究報道在胃癌輔助化療中CAP的CD-DST培養條件，故本研究對CAP的CD-DST檢測條件進行探索，對胃癌患者術后采用CD-DST法進行CAP體外藥敏實驗進而指導臨床CAP用藥具有重要意義。口服給藥后，CAP首先被肝臟中羧酸酯酶代謝為5'-脫氧-5-氟胞苷（5'-deoxy-5-fluorocytidine，5'-DFCR），然后通過肝臟和腫瘤組織中的胞苷脫氨酶將其轉化為5'-脫氧-5-氟尿苷（5'-deoxy-5-fluorouridine，5'-DFUR），最后在肝臟和腫瘤組織中胸苷磷酸化酶（thymidine phosphorylase，TP）的作用下，將5'-DFUR進一步代謝為5-FU發揮抗腫瘤作用[7]。研究證實，TP是一種與腫瘤相關的血管生成因子，在腫瘤細胞中的表達高于正常細胞，這可能是一些研究者報道的惡性腫瘤優先將5'-DFUR轉化為5-FU的重要原因之一。TP的活性決定了CAP的抗腫瘤效力[8-9]。由于CAP代謝過程復雜不僅需要多種酶同時參與，并且需要肝臟起始代謝，體外代謝比較受限，無法實現CAP的體外CD-DST檢測及評價，而5'-DFUR僅需在腫瘤細胞中經TP關鍵酶的一步代謝就可轉化為發揮抗腫瘤作用的5-FU，故本研究選擇CAP的代謝產物5'-DFUR進行CAP的CD-DST檢測條件探索。本研究選取65例新鮮胃癌組織標本，體外通過對不同藥物濃度的5'-DFUR進行CD-DST檢測及評價，并分析5'-DFUR在胃癌術后輔助化療中的敏感性與臨床有效率的一致性，進而確定CD-DST法評價CAP進行藥敏檢測的實驗條件。

1 對象與方法

1.1 研究對象

選取2015年5月至2017年9月北京多家綜合性三級甲等醫院的65例胃癌患者的新鮮腫瘤組織標本。患者納入標準：①術前經胃鏡活檢病理診斷為胃癌；②無嚴重全身系統性疾病；③無遠處轉移。排除標準：①術前采用化療或放療；②合并其他腫瘤；③有其他臟器切除。65例患者年齡38～87歲，性別、分型均隨機選取。將65例新鮮胃癌組織標本根據入組時間順序分為實驗組31例和驗證組34例。

1.2 主要試劑與儀器

DME/F-12 1∶1培養基購自美國HyClone公司；胎牛血清購自美國Thermo Fisher公司；乙二醇二乙醚二胺四乙酸（ethylene glycol diethyl ether diamine tetraacetic acid，EGTA）、伊立替康（irinotecan，CPT-11）購自美國Sigma公司；5'-DFUR購自日本TCI公司；奧沙利鉑（oxaliplatin，L-OHP）購自比利時CENEXI-Laboratoires THISSEN S.A.公司；膠滴藥敏檢測試劑盒Primaster?購自日本Kurabo公司。倒置顯微鏡購自日本Olympus公司；Primage圖像分析系統購自日本Kurabo公司。

1.3 CD-DST法[10-11]

1.3.1 原代腫瘤細胞分離與培養首先用生理鹽水洗滌腫瘤組織標本5次，然后用眼科剪將腫瘤組織標本剪成小塊，同時盡量去除如脂肪、黏膜、結締組織、壞死組織等非腫瘤細胞組織，再用刀片將組織切碎成泥狀，EZ酶消化1～2 h，1300 r/min離心3 min，收集消化后的腫瘤細胞團塊，將其接種于CG培養瓶中，用PCM-1培養基在37℃、5%CO2培養箱中預培養24 h，獲得原代胃癌細胞。

1.3.2 膠原凝膠滴培養培養24 h后，收集預培養的貼壁細胞，與試劑盒中膠原混合液（A∶B∶C=8∶1∶1）混合均勻，按照每膠滴30 μl，每孔3個膠滴，將細胞懸液接種于6孔板中，2 h后待膠滴凝固加入3 ml含10%胎牛血清的DME/F-12 1∶1培養基，于37℃、5%CO2培養箱中過夜培養。

1.3.3 抗腫瘤藥物接觸與清洗培養24 h后加入抗腫瘤藥物，藥物測試條件根據藥物服用特點、以往的研究結果及參考文獻[2,12-15（]表1），分別設未用藥物的陰性對照孔（Control）以及L-OHP和CPT-11（臨床胃癌常用藥）處理的陽性對照孔，同時將0-time組（加藥起點的未處理組）進行染色固定。培養相應時間后，用DME/F-12 1∶1培養基清洗2次，每次15 min，然后用無血清培養基PCM-2繼續培養5天，其中第3天更換一次培養基。

表1 抗腫瘤藥物接觸條件表

1.3.4 染色固定與掃描第9天進行染色固定，使用終濃度為50 μg/ml的中性紅染色2 h，磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗細胞 3次，每次5 min，中性福爾馬林固定45 min，蒸餾水清洗15 min，通風干燥，分析具有活性的腫瘤細胞。（圖 1）

圖1 染色固定干燥后的胃癌細胞（中性紅染色，×40）

1.4 數據分析

采用Primage圖像分析系統對膠滴進行分析。Control組吸光度（optical density，OD）值與0-time組OD值的比值表示生長率，若生長率小于0.8，則判定為檢測沒有意義[16]。

藥物敏感度通過加藥組OD值/Control組OD值（T/C）表示，若T/C＜50%，說明個體腫瘤細胞對相應藥物敏感度較高（高敏感）；T/C為50%～60%，說明個體腫瘤細胞對相應藥物敏感度處于高敏感與低敏感的臨界范圍（臨界）；T/C＞60%，說明個體腫瘤細胞對相應藥物敏感度較低（耐藥）。

2 結果

2.1 Primage圖像分析結果

采用Primage圖像分析系統對膠滴圖像數據進行讀取，原代腫瘤細胞團在膠滴內呈三維立體式增殖生長，與腫瘤細胞在人體內的生長環境相似。與加藥組相比，Control組腫瘤細胞活性好，增殖較快；加藥組呈現出不同程度的細胞凋亡，主要表現為細胞團變小且數量減少。（圖2）

圖2 編號20170523-709標本的Primage圖像分析結果（×40）

2.2 實驗組抗腫瘤藥物的CD-DST檢測結果

31例新鮮胃癌組織標本中，26例可評價，檢測成功率為84%（26/31），5例檢測失敗原因為腫瘤細胞含量低，生長率低于0.8。檢測成功的26例中，隨著5'-DFUR濃度（3、5、10 μg/ml）的增加，體外有效率（in vitro sensitivity，IVS）也呈增長趨勢，高敏感IVS分別為23%、31%和46%（表2），由于已報道CAP單藥的胃癌臨床有效率約為30%[17-18]，因此，本研究結果表明，胃癌體外藥敏實驗中，5 μg/ml的5'-DFUR為CAP體外藥敏檢測CD-DST法的最適實驗條件。

表2 實驗組抗腫瘤藥物的CD-DST檢測結果（n=26）

2.3 驗證組 5'-DFUR的CD-DST檢測結果

由于實驗過程中的胃癌標本有限，為了進一步驗證胃癌中5'-DFUR的IVS與CAP臨床有效率的一致性，采用5 μg/ml的5'-DFUR對另外34例胃癌標本進行了CD-DST法評價，其中1例檢測失敗，是由于腫瘤細胞量較少不足以檢測；33例可評價，檢測成功率為97%（33/34）。其中，高敏感IVS為30%（10/33），與實驗組結果一致，即 5 μg/ml的5'-DFUR的IVS與CAP臨床有效率一致。

3 討論

盡管臨床診斷和治療技術在不斷提高，但胃癌由于其高度異質性、術后易復發和轉移的特點，仍然是全球第三大癌癥死亡原因[19]。術后輔助化療是胃癌治療中的重要組成部分，目前一般采用經驗性用藥，但是由于腫瘤的異質性和患者的個體差異，導致療效差異顯著。隨著腫瘤個體化治療思想的提出，研究者建立了ATP生物熒光腫瘤體外藥敏檢測技術（ATP-tumor chemosensitivity assay，ATP-TCA）、MTT等體外藥敏檢測技術，但都存在一定的局限性。相較于上述方法，Kobayashi[11]提出的CD-DST法具有原代細胞培養成功率高、需要的腫瘤細胞量少、臨床相關性高、操作簡單、培養時間短以及避免成纖維細胞干擾等優點。研究表明，CD-DST法對胃癌原代細胞在化療藥物敏感性檢測中取得了較理想的結果[20]。

CAP、5'-DFUR以及5-FU是臨床上胃癌、結直腸癌輔助化療的常用藥，CAP與5'-DFUR以及5-FU相比，具有更好的安全性和有效性[6]。但作為口服抗癌前體分子的CAP在腫瘤組織細胞內選擇性地被TP代謝為5-FU，其療效已經在多個臨床試驗中確定，而且毒性小于5-FU，口服比持續靜脈注射更易被患者接受，因此，CAP可能是替代靜脈注射5-FU的理想選擇[21]。在進展期胃癌的化療中，CAP具有較高的抗癌活性，由于CAP的體外代謝受限，而5'-DFUR作為CAP重要的代謝產物，只需在腫瘤組織細胞中TP的作用下一步代謝即可轉化為發揮抗腫瘤作用的5-FU。為了胃癌患者術后采用CD-DST法進行CAP體外藥敏實驗，本研究選擇CAP的代謝產物5'-DFUR進行CAP的CD-DST藥敏檢測實驗條件探索。研究結果顯示，CD-DST法評價胃癌原代細胞對CAP的藥敏條件檢測結果穩定，胃癌原代細胞對不同濃度5'-DFUR的敏感度差異明顯，5 μg/ml的5'-DFUR在體外藥敏實驗條件檢測中對胃癌的高敏感率為30%左右，這與文獻報道的臨床CAP單藥一線治療晚期胃癌的有效率一致[22-23]。同時本研究結果顯示抗腫瘤藥物L-OHP和CPT-11的單藥敏感率檢測結果與實際臨床單藥治療有效率相符[24-25]。綜上結果表明，采用CDDST法評價分析CAP在胃癌術后輔助化療中的藥敏檢測條件對胃癌患者術后進行體外藥敏實驗及臨床化療藥物的選擇指導具有重要意義。

另有研究表明，CAP與第三代鉑類抗腫瘤藥物L-OHP聯合用藥對晚期胃癌療效顯著，且不良反應小[26]，而CD-DST技術作為臨床指導用藥的重要參考，本實驗室利用CD-DST法對CAP與L-OHP聯合用藥對腸癌原代細胞進行了體外藥敏檢測實驗條件探索，初步結果顯示，在腸癌中有效率約為55%，與文獻報道的年齡較小患者臨床有效率為58%和年齡較大患者臨床有效率為52%一致性較高[27]。而CAP與L-OHP聯合用藥對胃癌的IVS及其藥敏檢測實驗條件正在進一步研究中。針對聯合用藥方案的CD-DST藥敏檢測實驗條件及藥敏實驗是今后研究的方向，旨在為腫瘤患者術后進行體外藥敏實驗及臨床化療藥物的選擇指導提供重要參考。