人結腸癌組織中CAC1和Cyclin E的表達及其臨床意義

劉夢潔,王文娟,郭 卉,焦 敏,姜麗麗,孔 鶯,張 曉

(西安交通大學第一附屬醫院腫瘤內科,西安 710061;*通訊作者,E-mail:lingyinnancy@163.com)

結腸癌(colon cancer)是死亡率和發病率較高的惡性腫瘤之一。全球范圍內結腸癌發病率已位于男性癌癥第3位,女性癌癥第2位,每年新增病例120萬,每年死亡病例約為600 000例[1]。主要治療方法包括手術、放療、化療,以及靶向治療和免疫治療。盡管上述治療方法不斷改進,病死率有了明顯的下降,但在包括我國在內的有些國家,其5年生存率仍低于50%[2]。因此,本研究擬尋找新的分子靶標進而更好地研究結腸癌發生發展的分子機制。

細胞周期相關基因CAC1(CDK2-associated cullin 1)定位于人類10號染色體的10q25-26,NCBI將CAC1歸于與細胞周期相關的Cullin家族[3]。CAC1在多種正常組織都有表達,但表達程度不一。既往研究表明[4],CAC1在正常細胞的表達要低于腫瘤細胞,且與腫瘤細胞的惡性程度相關;亦有文獻報道[5],CAC1可以與CDK2結合,自身表達增高可以促進CDK2的活性增高,參與對細胞周期的調控,且主要在細胞周期從G1期向S期轉變時發揮作用,其與cullin家族中的cullin3同源性最高,有研究表明cullin3有助于Cyclin E的泛素化降解[6]。然而,盡管CAC1與cullin3同源,但有研究發現其對Cyclin E的調節卻與之不同,Cyclin E也是參與細胞周期從G1期向S期轉變時的重要正性調節因子,在多種惡性腫瘤中,如喉癌[7]、膽囊癌[8]等,Cyclin E呈高表達,其過度表達干擾了有絲分裂,形成的不穩定染色體則是誘發腫瘤形成的可能機制之一。目前,雖然已有不少研究關注CAC1與細胞周期相關蛋白在結腸癌發生發展過程中的作用,但聯合檢測CAC1和Cyclin E在結腸癌中的表達在國內外尚未有報道。為探討CAC1和Cyclin E與結腸癌臨床病理因素之間的關系及兩者的相關性,本實驗采用免疫組化SP方法,檢測201對人結腸癌組織和癌旁正常組織中CAC1和Cyclin E的表達,為進一步研究CAC1和Cyclin E的生物學功能奠定基礎。

1 資料與方法

1.1 臨床資料

標本取自西安交通大學醫學院第一附屬醫院普外科及腫瘤外科2011-01～2013-01手術切除后并經病理證實的201對人結腸癌組織和癌旁正常組織(距結腸癌遠端5 cm以上),所有病例術前均未進行化療和放療,其中男125例,女76例,年齡25-93歲(平均60歲,中位年齡62歲)。原發部位:右半結腸113例,左半結腸88例;低分化癌32例,中高分化癌169例;有淋巴結轉移者80例,無淋巴結轉移者121例;遠處轉移者28例,未遠處轉移者173例。根據美國抗癌協會聯盟(AJCC)第八版的標準進行國際TNM分期:Ⅰ期14例,Ⅱ期98例,Ⅲ期61例,Ⅳ期28例。標本獲取已獲得西安交通大學醫學院第一附屬醫院倫理委員會審查通過,所有患者均已簽署知情同意書。所有標本經常規100 ml/L中性甲醛液固定,石蠟包埋連續切片。

1.2 主要試劑

兔抗人多克隆抗體CAC1(GTX118514)購自美國GeneTex公司;鼠抗人多克隆抗體Cyclin E(sc-248)購自美國Santa Cruz公司;SP免疫組織化學試劑盒和DAB顯色試劑盒為北京中杉金橋生物技術有限公司。

1.3 方法和結果判定

采用免疫組化SP法檢測,嚴格按試劑盒說明步驟操作。陰性對照用PBS代替一抗。CAC1主要表達于細胞質內;Cyclin E主要表達于細胞核內,均表現為棕黃色或黃色顆粒。每張切片在高倍鏡下隨機選取5個視野,按腫瘤陽性細胞比例和著色強度分別進行計分。陽性細胞數:0%-5%為0分,>5%-25%為1分,>25%-50%為2分,>50%-75%為3分,>75%-100%為4分;染色強度無色為0分,淺黃色為1分,黃色為2分,棕黃褐色為3分。兩者得分乘積≥4分記為陽性,<4為陰性。陽性表達率為得分≥4分的病例數與總病例數的比值。

1.4 統計學方法

應用SPSS19.0統計軟件進行統計學分析。計數資料采用卡方檢驗或Fisher’s精確檢驗。相關性采用Spearman等級相關分析。P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 CAC1和Cyclin E在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達

免疫組化結果顯示,CAC1在結腸癌組織中的表達水平較高,主要表達于癌細胞的細胞質中,陽性表達呈現棕黃色或黃色顆粒;在癌旁組織中表達水平很低,統計學分析顯示,其在結腸癌組織中的陽性表達率為60.20%,明顯高于癌旁組織(19.40%),差異具有統計學意義(P<0.001)。Cyclin E主要表達位于細胞核中,其在癌組織中的陽性表達率為56.72%,顯著高于癌旁組織(11.94%),差異具有統計學意義(P<0.001,見圖1、表1)。

2.2 CAC1和Cyclin E的表達與結腸癌臨床病理特征間的關系

將已獲取的201例結腸癌組織中CAC1和Cyclin E的表達與臨床病理特征間的關系進行分析,結果顯示,CAC1在癌組織中的表達與淋巴結轉移、遠處轉移以及TNM分期相關(均P<0.05),與年齡、性別、原發部位、組織分化以及腫瘤浸潤深度無關;Cyclin E的表達與淋巴結轉移和TNM分期有關(均P<0.05),與年齡、性別、原發部位、分化程度、腫瘤浸潤深度以及遠處轉移無關(見表2)。

A.CAC1在結腸癌組織中陽性表達 B.CAC1在癌旁正常組織中陽性表達 C.Cyclin E在結腸癌組織中陽性表達D.Cyclin E在癌旁正常組織中陽性表達圖1 CAC1和Cyclin E在結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達 (SP,×400)Figure 1 The expression of CAC1 and Cyclin E in human colon tissues and paratumorous normal tissues (SP,×400)

表1 CAC1和Cyclin E在人結腸癌組織和癌旁正常組織中的表達 例(%)

Table 1 The expression of CAC1 and Cyclin E in human colon tissues and paratumorous normal tissues cases(%)

組別 n CAC1表達Cyclin E表達陽性χ2P陽性χ2P 癌組織 201 121(60.20)69.81<0.001114(56.72)88.81<0.001癌旁正常組織201 39(19.40)24(11.94)

表2 CAC1和Cyclin E的表達與結腸癌臨床病理特征間的關系

Table 2 Relationships of CAC1 and Cyclin E expression with clinicopathological features in human colon tissues

臨床病理特征nCAC1表達Cyclin E表達陽性例數χ2P陽性例數χ2P 年齡0.4130.5210.1580.691 <60歲915753 ≥60歲1106461性別1.2430.2652.2460.134 男1257976 女764238原發部位2.1300.1443.0530.081 右半結腸1136358 左半結腸885856組織分化2.1660.1412.2450.134 低322322 中/高1699892腫瘤浸潤深度3.7470.0532.5600.110 未超過固有肌層1877 超過固有肌層183114107淋巴結轉移6.7740.0094.9200.027 無1216461 有805753遠處轉移4.5830.0320.5980.439 無17399100 有282214TNM分期12.988<0.0014.6480.031 Ⅰ/Ⅱ1125556 Ⅲ/Ⅳ896658

2.3 CAC1和Cyclin E在結腸癌組織中的相關性

對CAC1和Cyclin E在結腸癌組織中的相關性進行分析,201例結腸癌組織中,CAC1表達陽性而Cyclin E表達陰性的患者有28例,Cyclin E表達陽性而CAC1表達陰性的患者有21例,兩者表達均為陽性的患者有93例,兩者均不表達者有59例。采用Spearman等級相關分析CAC1和Cyclin E表達的相關性結果顯示,兩者的表達呈正相關(r=0.500,P<0.001,見表3)。

表3 CAC1和Cyclin E在結腸癌組織中表達的相關性

Table 3 Correlation between CAC1 and Cyclin E expression in human colon cancer tissues

CAC1Cyclin E陽性陰性rP陽性93280.500<0.001陰性2159

3 討論

CAC1的最初發現是采用基因芯片技術分析直腸癌組織和正常直腸組織的基因表達差異,篩選發現的差異表達片段BM360862,隨后對差異片段進行了克隆,得到了新基因C10orf46ky,Genbank登錄號為AY743663。CAC1定位于人類染色體10q25-26,全長6.7 kb,AY743663基因序列全長4 335 bp,與CAC1 99%同源,不同的是其缺乏CAC1的3′末端,CAC1的ORF編碼369個氨基酸,分子量大小約為37 kD。有相關文獻報道該區段與結直腸癌的發生密切相關[9]。

既往研究表明,CAC1在乳腺癌、肺癌和胃癌等多種惡性腫瘤中呈高表達,而在人癌細胞系中,如結腸癌、人神經母細胞瘤、原始神經外胚層腫瘤、前列腺癌、乳腺癌,也發現了其不同程度的高表達狀態,且對這些腫瘤細胞系的細胞周期有一定的調控作用[5]。本實驗對獲取的201例結腸癌組織和對照的癌旁正常組織檢測了CAC1的表達,結果顯示,CAC1在癌組織中的表達明顯高于癌旁正常組織,且在有淋巴結轉移、遠處轉移、TNM分期高者,CAC1的表達水平明顯高于對照組或TNM分期低者。說明惡性程度高的腫瘤CAC1表達增多,提示CAC1可能在結腸癌的發生發展中起促進作用,其可作為預測結腸癌預后的一個指標。另外有研究表明[10],CAC1通過靶向miR-199a-5p參與結腸癌的耐藥問題,而最近又有文獻再次印證了CAC1參與結腸癌耐藥的這一過程[11],這也為我們后續深入的機制研究提供了方向。

Cyclin E主要定位于細胞核,屬于細胞周期蛋白家族,是G1期的正向調節因子,其調控細胞增殖主要是通過促進細胞從G1期向S期的轉變,Cyclin E的過度表達會導致細胞增殖失控從而形成腫瘤。既往研究表明,Cyclin E在宮頸癌[12]、結腸癌[13]、卵巢癌[14]、乳腺癌[15]、胃癌[16]等多種腫瘤中均有過表達,并且與腫瘤的發生、發展、侵襲和轉移以及預后都密切相關。本研究檢測了Cyclin E在結腸癌組織中的表達情況,發現其與淋巴結轉移和TNM分期相關,并對CAC1與Cyclin E的表達進行了相關性分析,結果顯示兩者顯著相關,提示CAC1可能通過調控Cyclin E參與了結腸癌細胞的增殖,這也與課題組既往研究結果相一致。

綜上所述,CAC1與Cyclin E在結腸癌組織中的高表達與結腸癌的惡性生物學行為如轉移、腫瘤進展密切相關,這一結果為結腸癌的早期診斷及預后判斷提供了可能的新指標。