毛果楊固有無序蛋白質基因克隆及脅迫響應分析

董實偉 楊宇寧 王乃銳 張含國 李淑娟

(林木遺傳育種國家重點實驗室，東北林業大學，哈爾濱 150040)

毛果楊(Populustrichocarpa)別名測序楊為楊屬青楊派植物，其中Nisqually-1基因型(雌株)是第一個有完整基因組注釋的木本植物，2006年其測序結果已公布[1]。Nisqually-1的組織培養技術已被廣泛使用，并已建立完整高效的遺傳轉化體系[2]，因此毛果楊已成為研究樹木生物學、比較基因組學和環境互作組學系統的模式物種[3]。

固有無序蛋白質(Intrinsically disordered proteins)簡寫為IDPs，是一類在天然狀態下整體或局部不折疊，缺乏穩定三維結構，但能夠正常行使生物學功能的蛋白質[4]，它普遍存在于蛋白質組中，參與信號轉導、轉錄調控、脅迫應答等一系列生物學過程[5]。固有無序蛋白質和有序蛋白質的氨基酸殘基組成上有明顯不同，主要體現在氨基酸的組成及理化性質等方面的差異[6～7]。例如，有些殘基有利于形成穩定的疏水中心進而折疊形成有序結構，這些氨基酸被稱為“促有序”氨基酸；與之相反，某些殘基阻礙蛋白質分子形成穩定的疏水核心和后續的折疊，無序結構中極性和帶電的氨基酸被稱之為“促無序”殘基[8～9]。另外，IDPs中氨基酸序列的復雜度較低，重復度較高，因此，IDPs的結構呈現一種松散的狀態，高度動態可變[10～11]。在發現初期許多固有無序蛋白質被認為并沒有什么功能，直到20世紀初證實了近100種蛋白質是固有無序蛋白質，無序蛋白質才成為研究領域關注的焦點[12]。Du等通過鹽脅迫對擬南芥中的ST6-66和ST255基因分離及耐鹽性分析，發現At1G13930基因敲除突變體對鹽脅迫超敏感[13]，Rocco等利用低溫4℃和高溫42℃對擬南芥進行處理，從而鑒定出38個蛋白差異位點，其中At1G13930蛋白在低溫和高溫處理時，與其他蛋白點相比較變化最大，研究表明At1G13930蛋白在溫度脅迫中可能起著至關重要的作用[14]。其他研究也證實植物中許多逆境響應蛋白均是固有無序蛋白質[15～17]。

為深入了解毛果楊固有無序蛋白質的功能，本研究以毛果楊野生型植株為材料，克隆并獲得PtrIDP1(Potri.010G161200.1)的cDNA全長序列，采用生物信息學方法對其序列特征及編碼蛋白結構等方面進行預測分析，瞬時轉化洋蔥表皮細胞進行亞細胞定位分析，同時對該基因在毛果楊不同組織中的表達特異性及不同類型非生物脅迫下的表達特性進行分析，旨在為后續探究該基因的功能及其在毛果楊生長發育過程中的作用奠定基礎。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及主要試劑

試驗材料：供試植物-Nisqually-1基因型的毛果楊野生型組培苗，在林木遺傳育種國家重點實驗室(東北林業大學)溫室培養，室內溫度25±2℃。光照強度為80 μmol·m-2·s-1)，長日照培養。

主要試劑：cDNA反轉錄試劑盒購于百泰克公司；PCR酶KOD FX購于東洋紡(上海)生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒和質粒小提試劑盒等購于天根公司；限制性內切酶和T4DNA連接酶購于賽默飛世爾科技公司。

1.2 試驗方法

1.2.1 毛果楊總RNA的提取與反轉錄

選取生長狀態良好且長勢一致、苗齡30 d的毛果楊組培苗全株，經無菌水洗凈后，液氮研磨成粉末，采用CTAB法提取植株總RNA，用超微量紫外分光光度計檢測RNA的濃度和純度，用1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測RNA的完整性。以上述得到的RNA為模板，根據cDNA反轉錄試劑盒的操作說明進行試驗，合成cDNA第一鏈，于-20℃保存。

1.2.2 引物設計及目的基因克隆

從Phytozome數據庫中獲取毛果楊PtrIDP1基因的全長序列，采用Primer5.0軟件設計引物(見表1)，引物由哈爾濱市擎科嘉美生物科技有限公司合成。以cDNA為模板，利用KOD-FX PCR酶進行PCR擴增。PCR反應體系(50 μL)：ddH2O 10 μL，2x PCR buffer for KOD FX 25 μL，2 mmol·L-1dNTPs 10 μL，上下游引物各1.5 μL，模板cDNA 1 μL，KOD FX 1 μL。擴增條件：94℃，2 min；98℃，10 s，58℃，30 s，68℃，30 s，35個循環；68℃，10 min；16℃保溫。1.5%瓊脂糖凝膠電泳對擴增產物進行檢測并對目的片段進行回收，將回收產物與pROK-Ⅱ載體連接，并轉入到大腸桿菌DH5α感受態細胞中，37℃過夜培養后挑取單菌落進行PCR檢測，將條帶位置正確的菌株送至生工生物工程(上海)有限公司測序。

表1 引物序列

1.2.3 PtrIDP1基因的生物信息學分析

使用在線工具CLUSTALW將獲得的核苷酸和氨基酸序列與NCBI中已登錄的12種植物序列進行比對和同源性分析，結合MEGA 5.0軟件構建系統進化樹，并對蛋白進行理化性質、跨膜區預測、親水性疏水性、二級結構與三級結構分析(見表2)。

表2 生物信息學分析網站及軟件

Table 2 Softwares and websites for bioinformatics analysis

功能Function軟件及網址Softwareandwebsite蛋白質理化性質Physicochemicalpropertiesofproteinhttp://web.expasy.org/protparam/跨膜區預測Transmembraneregionanalysishttp://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM親水性疏水性預測Pro/hydrophobicanalysishttps://web.expasy.org/protscale/蛋白二級結構Secondarystructureofproteinhttps://npsa-prabi.ibcp.fr/蛋白三級結構Tertiarystructureofproteinhttps://www.swissmodel.expasy.org/同源多序列比對Homologousmultiplesequencealignmenthttps://www.genome.jp/tools-bin/clustalw系統進化樹PhylogenetictreeMEGA5.0

1.2.4 PtrIDP1蛋白亞細胞定位

為了研究PtrIDP1蛋白的亞細胞定位，克隆無終止密碼子的全長PtrIDP1 CDs序列，將其連接到pGWB5載體上，構建35s::PtrIDP1-GFP融合表達載體，35s::GFP用作對照，利用基因槍轉化法，分別將35s::GFP與35s::PtrIDP1-GFP融合表達載體轉入洋蔥表皮細胞，暗培養36～48 h后利用激光共聚焦顯微鏡觀測拍照。

1.2.5 PtrIDP1基因的組織特異性表達檢測

根據基因序列設計特異定量引物，以PtrActin為內參設計引物actin-F及actin-R(見表1)，進行QRT-PCR分析。體系如下：2×TransStart? TOP/Tip Green qPCR Supermix 10 μL、PtrIDP1-QF/QR混合引物(10.0 μmol·L-1)0.4 μL、cDNA 1.5 μL，Passive Reference Dye(50×)0.4 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應程序如下：94℃ 30 s；94℃ 5 s，60℃ 15 s，72℃ 35 s，40次循環；95℃ 15 s，60℃ 1 min，95℃ 30 s。每個樣品進行3次生物學重復，利用2-ΔΔCT法進行數據處理。

1.2.6PtrIDP1基因在不同類型非生物脅迫下的表達特性分析

選取30 d苗齡長勢一致的毛果楊植株分別進行鹽脅迫(200 mmol·L-1NaCl溶液)和干旱脅迫(40%的PEG溶液)處理，并分別于處理0、6、12、24、48、72 h后進行取材。以野生型毛果楊的根、莖和葉為材料提取總RNA，反轉錄合成cDNA后，以PtrIDP1-QF/QR為引物，PtrActin為內參，試驗重復3次，對研究結果進行qRT-PCR分析。

2 結果與分析

2.1 PtrIDP1基因克隆

提取的RNA經1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，28s RNA、18s RNA條帶明顯，5s RNA條帶呈微弱彌散狀(見圖1A)，結果表明提取的總RNA質量完好，可用于后續試驗。

以毛果楊的cDNA為模板，采用特異性引物對PtrIDP1基因序列進行擴增，擴增產物經1%瓊脂糖凝聚膠電泳檢測，結果顯示與預期目的片段423 bp大小基本一致(見圖1B)，條帶清晰且無明顯拖尾。將菌液送至生工生物工程(上海)有限公司測序，結果表明：該基因克隆成功，命名為PtrIDP1，可以進行后續操作。

圖1 毛果楊總RNA(A)和擴增產物電泳圖(B)Fig.1 The electrophoresis of Total RNA in P.trichocarpa(A) and PCR production of PtrIDP1(B)

2.2 PtrIDP1基因生物信息學分析

2.2.1 蛋白質的一級結構分析

通過ExPAsy分析顯示，毛果楊PtrIDP1基因蛋白分子式為C630H1009N179O217S3，完整的CDs區序列長度為423 bp，共編碼140個氨基酸(見圖2)。預測其蛋白分子量為14.659 19 kD，理論等電點(pI)為5.58，脂溶指數為58.71，總平均親水系數為-0.716，不穩定系數為29.60，說明該蛋白為穩定的酸性親水蛋白(見圖3)，對PtrIDP1跨膜結構域進行分析，結果表明PtrIDP1基因所編碼的蛋白質具有跨膜結構域，為跨膜蛋白(見圖4)。

圖2 PtrIDP1基因序列及氨基酸序列Fig.2 The nucleotide and amino acid sequences of PtrIDP1

圖3 PtrIDP1蛋白的親/疏水性分析預測Fig.3 Pro/hydrophobic analysis of PtrIDP1 protein

圖4 PtrIDP1蛋白的跨膜區域分析預測Fig.4 Transmembrane region Analysis of PtrIDP1 protein

圖5 PtrIDP1蛋白二級結構預測Fig.5 Prediction of secondary structure of PtrIDP1 protein

2.2.2 蛋白質的二級結構預測分析

采用在線軟件SOPMA對毛果楊PtrIDP1蛋白的二級結構組成進行預測分析，結果表明，蛋白質二級結構主要包含α-螺旋65個，占46.43%，β-折疊2個，占1.43%，無規則卷曲73個，占52.14%(見圖5)。

VL-XT預測結果顯示，在PtrIDP1的蛋白質中存在3個無序區，無序氨基酸殘基共78個，分別是1-26、38-52、88-124位氨基酸組成，這些氨基酸的score>0.5。PtrIDP1蛋白的全序列中有3個區中氨基酸的組成趨向于形成有序結構(1,2,3)，這3個區域可能是無序蛋白中的有序結合位點。PtrIDP1蛋白質具有無序特征(見圖6)。

圖6 PtrIDP1蛋白質無序預測Fig.6 Disorder prediction of PtrIDP1 protein

圖7 蛋白質三級結構預測 A,D.蛋白三級結構正面圖；B,E.蛋白三級結構側面圖；C,F.三級結構背面圖Fig.7 Prediction of tertiary structure of PtrIDP1 protein A,D.Represent the front view of the protein tertiary structure; B,E.Represent the side view of the protein tertiary structure; C,F.Represent the rear view of the protein tertiary structure

圖8 不同植物PtrIDP1蛋白系統進化樹分析Fig.8 Phylogenetic analysis of PtrIDP1 from different plants

圖9 PtrIDP1蛋白的亞細胞定位 A～B,E～F.35s::GFP對照；C～D,G～H.35s::PtrDP1-GFP融合蛋白Fig.9 Subcellular location of PtrIDP1 protein A-B,E-F.35s::GFP ontrol；C-D,G-H.35s::PtrDP1-GFP fusion protein

2.2.3 蛋白質三級結構預測

采用SWISS-MODEL工具，運用同源建模法對PtrIDP1基因編碼的蛋白質進行三級結構建模，由于無序蛋白質三級結構并不穩定，所以預測結果顯示兩種不同的構象(見圖7)。

2.2.4 基因的同源性分析及進化樹分析

利用MEGA5軟件構建該蛋白的系統發育進化樹(見圖8)，結果顯示，在候選的12種不同植物中，毛果楊與胡楊親緣關系較近。

2.3 PtrIDP1蛋白亞細胞定位

利用激光共聚焦顯微鏡觀察拍照結果顯示：對照35s::GFP在細胞核與細胞質中均檢測到GFP熒光信號，而35s::PtrIDP1-GFP融合蛋白僅在細胞核中檢測到GFP信號，且與細胞核特異性染料DAPI染色位置一致(見圖9)。上述結果表明PtrIPD1定位于細胞核。

2.4 基因的表達特性

以毛果楊根、莖、葉分別為模板，通過qRT-PCR檢測分析PtrIDP1在毛果楊不同部位的相對表達量(見圖10)。結果顯示，PtrIDP1在葉片和莖中高度表達，在葉片中的表達量是根部表達量的27倍。

圖10 PtrIDP1基因組織特異性表達分析Fig.10 Tissue specific expression analysis of PtrIDP1

圖11 NaCl脅迫處理下PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中的相對表達量Fig.11 Relative expression of PtrIDP1 in root,stem and leaf of P.trichocarpa under NaCl stress(**P<0.01)

圖12 PEG脅迫處理下PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中的相對表達量Fig.12 Relative expression of PtrIDP1 in root,stem and leaf of P.trichocarpa under PEG stress(**P<0.01)

為分析毛果楊PtrIDP1對非生物脅迫的表達模式，我們分別對200 mmol·L-1NaCl和40% PEG-6000兩種逆境脅迫條件下毛果楊根、莖、葉組織中該基因的表達情況進行分析。在NaCl脅迫處理后，毛果楊根中PtrIDP1基因表達量呈先升高后降低的趨勢，在6 h時表達量達到最高，是對照的2.4倍；莖中PtrIDP1基因在所有時間點均為下調表達，在48 h表達量最低，是對照的0.1倍；葉中該基因表達量在0～24 h內基本持平，然后出現迅速降低、再升高的趨勢，72 h時達到最高(見圖11)。由此可見根部對高鹽脅迫反應更敏感；在PEG干旱脅迫下，毛果楊根和莖部PtrIDP1基因在所有時間點均表現為下調表達，其中根部在6 h時表達量最低，僅為對照的0.2倍，而莖部在12 h表達量最低，僅為對照的0.06倍；而在葉中該基因在脅迫12 h以內的表達量與對照基本持平，在24 h時表達量達到最高，是對照的1.4倍，然后呈逐漸降低的趨勢(見圖12)，可見在干旱脅迫時葉片的脅迫響應更敏感。

3 討論

干旱、高鹽、低溫、高溫等極端條件，是植物生長過程中所面臨的主要逆境因素[18～19]。在逆境條件下，許多植物中所特有的IDPs對抵抗逆境脅迫發揮了重要作用[8～11]。本研究從毛果楊中克隆得到了PtrIDP1基因，選取了胡楊等13種植物的基因序列進行多序列比對及進化樹分析，結果顯示：毛果楊PtrIDP1與胡楊氨基酸相似性最高。

PtrIDP1是植物中特有的固有無序蛋白質，在擬南芥中被稱為At1G13930，At1G13930具有一定的組織特異性，在根尖、花藥、柱頭組織不表達，在生長點表達量較高，在葉中定位在保衛細胞中，逆境脅迫下At1G13930參與氣孔的發育及調節[11]。本研究中PtrIDP1基因的亞細胞定位觀察顯示，該基因定位在洋蔥表皮細胞的細胞核內。通過RT-PCR對PtrIDP1基因在毛果楊不同組織部位的表達特異性進行了全面分析，結果表明，PtrIDP1在毛果楊根、莖、葉中都有表達，其中，在葉和莖中表達量相對較高，在根中表達量相對較低。該基因在葉片中高度表達，揭示PtrIDP1基因可能與葉片的光合作用或者氣孔的發育及調節相關，在莖段中高度表達，預示PtrIDP1可能與植物生長發育相關。

PtrIDP1基因不僅具有組織特異性，而且能夠被逆境脅迫誘導表達。例如，擬南芥在逆境脅迫下，發現該基因所編碼的蛋白與低溫、高溫及高鹽等非生物脅迫相關[10～11]。Rocco等利用低溫4℃和高溫42℃對擬南芥進行處理，發現該基因所編碼的蛋白在低溫和高溫處理時，與其他蛋白點比較變化最大，暗示該基因在溫度脅迫中可能起著至關重要的作用[14]。在本研究中，毛果楊在NaCl(高鹽)和PEG(干旱)脅迫下，PtrIDP1基因表達量的變化趨勢有所不同。在NaCl脅迫下，毛果楊根中的表達量明顯上調，脅迫6 h時是對照的2.4倍，而在莖中是明顯下調表達，在葉中24 h之前的表達量變化不顯著，這說明毛果楊根部對鹽脅迫更敏感，莖中通過該基因的下調表達來應對鹽脅迫，葉組織在脅迫48 h之后才做出鹽脅迫應答；在PEG脅迫下，毛果楊根和莖部在所有時間點均表現為下調表達，根部在6 h時表達量最低，是對照的0.2倍，而莖部在12 h表達量最低，是對照的0.06倍；而在葉中的表達量與對照基本持平，在24 h時表達量達到最高，是對照的1.4倍，可見葉片對干旱脅迫的響應更快。初步分析認為，毛果楊PtrIDP1基因的表達可能參與鹽脅迫和干旱脅迫的應答。PtrIDP1基因在響應高鹽和干旱脅迫過程中的調控途徑及作用機制還有待進一步分析和驗證。