小黑楊PsnHB13基因在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與功能分析

肖 迪 劉 軼 李開隆 鄭 密 曲冠證

(東北林業(yè)大學林木遺傳育種國家重點實驗室，哈爾濱 150040)

同源異型域——亮氨酸拉鏈(HD-Zip)蛋白是植物界所特有的一類轉(zhuǎn)錄因子，具有結(jié)合特異DNA的活性及調(diào)控其轉(zhuǎn)錄的能力。研究證實HD-Zip蛋白經(jīng)由亮氨酸拉鏈形成二聚體，這個二聚體是DNA結(jié)合的先決條件，而且該蛋白參與到植物特異性生物過程如光合作用、形態(tài)建成等中，在植物的生長發(fā)育中扮演重要角色[1]。

目前，在一些植物中已經(jīng)開展了全基因組范圍內(nèi)的HD-Zip基因家族的鑒定，如擬南芥中鑒定出48個HD-Zip基因[2]，水稻33個[3]，玉米55個[4]，毛果楊63個[5]，小麥46個[6]，棉花61個[7]。可根據(jù)HD-Zip基因家族編碼基因的內(nèi)含外顯模式、含有除HD-Zip外的其他保守結(jié)構(gòu)域、基因所參與的代謝途徑等將HD-Zip分為Ⅰ～Ⅳ四個亞家族[8]。不同亞家族的基因含有的結(jié)構(gòu)域及其編碼蛋白的結(jié)構(gòu)均有差異，導致HD-Zip家族基因參與植物不同的發(fā)育過程。其中HB13是HD-ZipⅠ亞家族的成員之一，結(jié)合生物信息學分析與已有的實驗研究[9]，提出了該亞家族蛋白的結(jié)構(gòu)模型：HD-Zip結(jié)構(gòu)域負責結(jié)合DNA與二聚體化，AHA結(jié)構(gòu)域負責激活轉(zhuǎn)錄，CTR和NTR區(qū)域通過控制磷酸化與泛素化對轉(zhuǎn)錄激活功能進行調(diào)節(jié)。同時該亞家族已被鑒定在光信號轉(zhuǎn)導、非生物脅迫、葉片發(fā)育等方面發(fā)揮重要的作用[10～11]。AtHB13高水平表達可阻止表皮細胞橫向擴張，導致轉(zhuǎn)基因擬南芥子葉及葉片的發(fā)育改變，即轉(zhuǎn)基因植株中子葉和葉片變得更窄，葉子和葉柄間的連接處不明顯等[1]。此外有研究表示，ATHB13在調(diào)節(jié)糖信號轉(zhuǎn)導中也發(fā)揮著作用[4]。HB13基因在不同植物之間的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機制具有保守性[12]，這也為我們在煙草中快速研究該基因的功能提供了有力的理論依據(jù)。

楊樹被作為木本轉(zhuǎn)基因植物中的模式植物，是目前林木樹種遺傳轉(zhuǎn)化研究中的典型代表種。小黑楊(Populussimonii×Populusnigra)是中國林業(yè)科學院于1959年經(jīng)小葉楊和黑楊雜交而來[13]。目前，有關(guān)楊樹HB13基因的功能驗證研究鮮有報道。以小黑楊為材料，參考轉(zhuǎn)錄數(shù)據(jù)克隆PsnHB13基因，通過構(gòu)建植物表達載體并利用農(nóng)桿菌侵染煙草，獲得轉(zhuǎn)基因煙草。發(fā)現(xiàn)楊樹PsnHB13基因能夠?qū)е聼煵萑~片、根系和花器官等形態(tài)發(fā)生變化。為進一步開展楊樹HB13基因的生理功能研究奠定基礎，為楊樹生長發(fā)育機理的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與主要試劑

楊樹葉片采自東北林業(yè)大學校園多年生的小黑楊雄株；普通煙草(NicotianatabacumL.)由本實驗室保存；大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；農(nóng)桿菌菌株GV3101購自上海唯地公司。質(zhì)粒提取和膠回收試劑盒，購自博日公司；植物表達載體pROKⅡ質(zhì)粒，由山東師范大學張慧教授惠贈；pEasy-T1載體、EasyPure Plant購自北京全式金生物技術(shù)有限公司；PCR相關(guān)試劑、DNA Marker、限制性內(nèi)切酶XbaⅠ、KpnⅠ，DNA Ligation Kit Ver.2.1，TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit，PrimeScripTMRT reagent Kit，DNA Fragment Purification Kit，SYBR Premix ExTaqTMⅡ均購自TaKaRa公司(大連)；所用引物合成、測序服務由博仕生物技術(shù)有限公司完成(哈爾濱)；其他實驗試劑為進口或國產(chǎn)分析純。

2 實驗方法

2.1 目的基因的克隆

參照TaKaRa公司RNA提取試劑盒說明書，提取小黑楊葉片的總RNA。利用Nanodrop 2000分光光度計檢測RNA的純度和濃度，取0.5 μg RNA為材料，利用PrimeScriptTMRT reagent Kit試劑盒反轉(zhuǎn)錄合成第一鏈cDNA。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)，設計小黑楊PsnHB13基因特異性引物擴增目的片段，所用引物見表1。PCR反應體系為模板2 μL，引物PsnHB13-XbaⅠ-F 1 μL、PsnHB13-KpnⅠ-R 1 μL、10×Buffer 2.5 μL、ExTaq0.25 μL、dNTP 2 μL，用ddH2O補足至25 μL，反應條件為94℃ 5 min，94℃ 30 s，56℃ 30 s，72℃ 1 min，35個循環(huán)；72℃ 7 min。反應結(jié)束后取25 μL PCR產(chǎn)物進行1%瓊脂糖凝膠電泳，選取條帶大小正確的進行膠回收。

2.2 植物表達載體的構(gòu)建及農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化

用限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ對膠回收的目的條帶和pROKⅡ質(zhì)粒進行酶切反應。純化酶切產(chǎn)物并用DNA Ligation Kit進行連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞，涂布含有卡那霉素的LB平板培養(yǎng)，37℃恒溫培養(yǎng)16 h。挑取單克隆進行菌液PCR驗證，并將陽性轉(zhuǎn)化子送測序。選擇測序成功的菌液保存并提取質(zhì)粒，利用液氮凍融法將pROKⅡ-PsnHB13質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細胞內(nèi)，隨機挑取單克隆進行PCR檢測，擴增引物pROKⅡ-F和PsnHB13-KpnⅠ-R序列見表1。

2.3 煙草的遺傳轉(zhuǎn)化及分子檢測

參照本實驗室的煙草轉(zhuǎn)化體系進行植物的遺傳轉(zhuǎn)化[14～17]。步驟包括：菌液的制備、侵染、共培養(yǎng)、脫菌和分化及生根培養(yǎng)等5部分組成。制備OD600=0.2～0.3的菌液，用菌液侵染切割成1 cm×1 cm大小的煙草葉片，共培養(yǎng)2 d后，在含有40 mg·L-1卡那霉素、400 mg·L-1頭孢霉素的分化培養(yǎng)基上培養(yǎng)，培養(yǎng)約21 d后將抗性芽進行抽莖生長，最后轉(zhuǎn)移到生根培養(yǎng)基上進行生根培養(yǎng)。利用CTAB法提取抗性苗葉片DNA，利用引物pROKⅡ-F，PsnHB13-KpnⅠ-R進行PCR反應，PCR擴增產(chǎn)物經(jīng)1%瓊脂糖凝膠電泳，篩選陽性轉(zhuǎn)基因株系。

表1 本實驗中所用的引物

注：下劃線:限制性內(nèi)切酶酶切位點

Note:Underline:Locus of restriction enzyme

2.4 實時熒光定量PCR檢測PsnHB13基因表達量

利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取生長30 d的不同轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草幼苗葉片總RNA。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板，利用定量引物PsnHB13-RT-F和PsnHB13-RT-R(表1)，參考SYBR Premix ExTaqTMⅡ反應體系，以Ntactin基因為內(nèi)參基因，進行定量PCR檢測。利用2-ΔΔCt法分析定量數(shù)據(jù)，計算不同株系中PsnHB13基因的相對表達量。

2.5 過表達PsnHB13煙草植株的表型觀察

挑選表達量較高3個轉(zhuǎn)基因株系及野生型株系移栽到10×12營養(yǎng)缽中。培養(yǎng)溫度26℃，長日照培養(yǎng)，光照時間18 h。培養(yǎng)30 d后，分別選取5株各轉(zhuǎn)基因株系及野生型煙草的第七片葉片(從上到下數(shù))，拍照后使用Image J軟件計算葉面積。利用游標卡尺測量葉片的最長長度與寬度，計算長寬比。使用普通光學顯微鏡對葉片下表皮細胞顯微觀察，拍照后測量單位面積內(nèi)細胞數(shù)量，使用Image J軟件計算細胞平均面積。轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草在移栽60 d左右均開始開花，7 d后進入盛花期，觀察轉(zhuǎn)基因煙草株系與野生型煙草株系同期開放的花朵。

通過轉(zhuǎn)錄組得到的PsnHB13基因序列，在TAIR網(wǎng)站(https://www.arabidopsis.org)進行序列比對，發(fā)現(xiàn)與AtHB13基因相似度較高，其在TAIR網(wǎng)站的命名為AT1G69780。而AtHB13基因是擬南芥植株幼苗根系生長的負調(diào)控因子，可能抑制根系生長。所以為探究PsnHB13是否同樣具有該功能則連續(xù)篩選4代轉(zhuǎn)基因煙草種子，獲得純合轉(zhuǎn)基因煙草。點種到MS基本培養(yǎng)基中(MS+20 g·L-1蔗糖+7.5 g·L-1瓊脂，pH5.8)。每7 d測量1次轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草根長，連續(xù)測量5次并記錄。

3 結(jié)果與分析

3.1 小黑楊PsnHB13基因的克隆及植物表達載體的構(gòu)建

PsnHB13基因的cDNA長度為870 bp，共編碼289個氨基酸(圖1)。該基因編碼蛋白的分子量為32.99 kDa，蛋白質(zhì)的等電點為5.94。利用TaKaRa MiniBEST Plant RNA Extraction Kit試劑盒提取小黑楊葉片的總RNA(見圖2A)。以反轉(zhuǎn)錄后的cDNA為模板克隆PsnHB13基因，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳后在900 bp左右處有亮帶，條帶位置大小正確(見圖2B)。PCR產(chǎn)物連接pEasy-T1載體，轉(zhuǎn)化Trans1-T1大腸桿菌感受態(tài)后挑取6個單克隆PCR檢測，瓊脂糖凝膠電泳檢測結(jié)果顯示均為陽性單克隆，且條帶大小正確。選取3個陽性單克隆測序，測序引物為pROKⅡ-F/R。限制性內(nèi)切酶XbaⅠ和KpnⅠ同時酶切pEasy-T1-HB13質(zhì)粒和pROKⅡ質(zhì)粒，膠回收純化基因片段酶切產(chǎn)物(見圖2C)，使用DNA Fragment Purification Kit試劑盒純化pROKⅡ質(zhì)粒酶切產(chǎn)物。用DNA Ligation Kit連接純化后的基因片段與載體，重組載體暫命名為pROKⅡ-PsnHB13。將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌Trans1-T1感受態(tài)細胞中，隨機挑取8個單克隆經(jīng)pROKⅡ-F/PsnHB13-KpnⅠ-R引物PCR驗證，電泳結(jié)果均為陽性單克隆，且條帶大小正確(見圖2D)。提取1#菌液質(zhì)粒進行雙酶切檢測(XbaⅠ和KpnⅠ)，電泳后在約900 bp處有亮帶，證明成功將PsnHB13基因構(gòu)建到pROKⅡ載體。并將質(zhì)粒送公司測序檢測。測序結(jié)果表明，PsnHB13基因已經(jīng)重組到pROKⅡ載體上，且沒有堿基序列突變，pROKⅡ-PsnHB13載體構(gòu)建成功。

圖2 植物表達載體pROKⅡ-PsnHB13的構(gòu)建 A.小黑楊葉片總RNA(1～2.小黑楊葉片總RNA)；B.PsnHB13基因的克隆電泳圖(1～3.PsnHB13基因的PCR擴增產(chǎn)物，4.ddH2O作為陰性對照)；C.植物表達載體pEasy-T1-PsnHB13的雙酶切電泳圖(1～3.重組質(zhì)粒的雙酶切產(chǎn)物)；D.農(nóng)桿菌GV3101轉(zhuǎn)化子的菌液PCR檢測電泳圖(1～8.不同農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化子單克隆，9.ddH2O作為陰性對照)；M：DL5000 DNA markerFig.2 The construction of pROKⅡ-PsnHB13 vector A.The total RNA of leaves of Populus simonii×P.nigra; B.The cloning of PsnHB13 gene(1-3.PCR product of PsnHB13 gene; 4.ddH2O as a negative control); C.The double digestion result of plant expression vector pEasy-T1-PsnHB13(1-3.Double digestion of recombinant plasmids); D.PCR detection of Agrobacterium-mediated transformation(1-8.PCR products of transformants in agrobacterium; 9.ddH2O as a negative control); M.DL5000 DNA marker

圖3 轉(zhuǎn)基因煙草的獲得及PsnHB13基因在煙草中的相對表達量 A.轉(zhuǎn)基因植株的PCR檢測(M.DL5000 DNA marker，1.陽性對照，2～14. 13個轉(zhuǎn)基因煙草株系，15.野生型植株，16. ddH2O作為陰性對照)；B.轉(zhuǎn)基因植株的qRT-PCR檢測(L1～L13.轉(zhuǎn)基因煙草植株)；C.移栽至土中的轉(zhuǎn)基因植株(CK.野生型植株，L6、L1、L7.不同株系轉(zhuǎn)基因煙草)Fig.3 Acquirement of transgenic tobacco and relative expression level of AtPAP1 gene in tobacco A.Detection of different transgenic tobaccos by PCR(M. DL5000 DNA marker; 1. Positive control; 2-14. Different lines, 15. Wild type; 16. ddH2O as a negative control); B.The qRT-PCR detection of transgenic plants(L1-L13.Transgenic tobacco plants of PsnHB13); C.The mature plant in soil(CK.Wild-type plant; L6,L1,L7.The transgenic plant with target gene)

3.2 pROKⅡ-PsnHB13載體在煙草中的遺傳轉(zhuǎn)化與分子檢測

采用葉盤轉(zhuǎn)化法，將帶有重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌侵染煙草葉片，經(jīng)過4～5周的篩選培養(yǎng)，葉片周圍的愈傷組織分化出抗性芽。將抗性芽分離后，放在含有卡那抗生素的分化培養(yǎng)基上繼代培養(yǎng)，得到大量叢生芽，待叢生芽抽莖后移栽至生根培養(yǎng)基中進行生根培養(yǎng)。提取煙草生根苗幼葉DNA，PCR檢測陽性轉(zhuǎn)基因植株。根據(jù)檢測結(jié)果，共得到13個轉(zhuǎn)基因株系(見圖3A)。

為了研究小黑楊PsnHB13基因在煙草植株中的表達情況，提取組培煙草生根苗幼葉總RNA，進行熒光定量PCR檢測(見圖3B)。結(jié)果顯示，小黑楊PsnHB13基因轉(zhuǎn)化到煙草植株中均有表達，以表達量最低的煙草轉(zhuǎn)基因株系L13中PsnHB13基因表達量為參考，相對表達量最高的株系是L6、L1、L7，這3個株系用于后續(xù)實驗的觀察分析(見圖3C)。

3.3 過表達PsnHB13煙草植株的葉片長寬比分析

將表達量較高的3個轉(zhuǎn)基因植株和野生型植株移栽到土壤，14 d后觀察葉片形態(tài)變化。在營養(yǎng)生長期對煙草成熟葉片進行測量、統(tǒng)計并利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型相比，轉(zhuǎn)基因煙草隨著PsnHB13表達量升高葉片長寬比明顯增加，葉片變小。單位面積(149 μm×149 μm)內(nèi)細胞數(shù)顯著降低，細胞面積增大。與野生型煙草葉片相比，3個高表達轉(zhuǎn)基因煙草株系葉片均顯著變小(見圖4A)。測量葉片最長長度與寬度，計算長寬比(見圖4B)，發(fā)現(xiàn)高表達PsnHB13基因的煙草葉片葉型出現(xiàn)變化，與野生型相比，長寬比增加近1.8倍，葉片細長。對3個轉(zhuǎn)基因株系及野生型株系的葉片面積與成熟葉片下表皮細胞顯微觀察并測量，利用SPSS19.0軟件進行統(tǒng)計學差異分析，發(fā)現(xiàn)與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草成熟葉片細胞個數(shù)明顯減少，雖然轉(zhuǎn)基因植株下表皮葉片細胞面積略有增加但未達到顯著差異(見圖4:C～D)。推測是由于PsnHB13過表達影響葉片細胞增殖數(shù)量，細胞數(shù)量降低，造成葉片變小。PsnHB13基因表達量最高的株系L7，葉片變小程度最大，出現(xiàn)小葉表型。

圖4 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草葉片形態(tài)學觀察與分析 A.煙草葉片面積比較；B.葉片長寬比的比較；C.煙草葉片的細胞數(shù)比較；D.煙草葉片的細胞面積比較；CK.野生型植株；L6,L1,L7.轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.4 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Comparison of the leaf area; B.Comparison of the length-width ratio; C.Comparison of the total cell number; D.Comparison of the cell area; CK.Wild type; L6,L1,L7.Individual transgenic plant

圖5 野生型和轉(zhuǎn)基因煙草幼苗根系長度的形態(tài)學觀察與分析 A.煙草早期幼苗根系長度的連續(xù)觀察；B.第六周的煙草早期幼苗根系長度觀察；CK.野生型植株；L1,L7.轉(zhuǎn)基因煙草株系Fig.5 Microscope observation and analysis of wild type and transgenic tobacco A.Continuous observation of the the length of seedling roots; B.Observation of the length of seedling roots at the sixth week; CK.Wild type; L1,L7.Individual transgenic plant

3.4 過表達PsnHB13煙草植株的幼苗根系長度分析

通過對轉(zhuǎn)基因煙草與野生型煙草幼苗時期根系長度連續(xù)測量、統(tǒng)計并利用SPSS19.0軟件進行差異分析。發(fā)現(xiàn)與野生型煙草植株相比，轉(zhuǎn)基因煙草根系生長緩慢。轉(zhuǎn)基因煙草根系長度在第一周測量時與野生型已經(jīng)開始發(fā)生差異，持續(xù)到第6周，差異逐漸增大(見圖5A)。轉(zhuǎn)基因煙草株系幼苗根系明顯短于野生型，生長到第6周時根系長度僅為野生型的1/3左右(見圖5B)。可以發(fā)現(xiàn)PsnHB13基因的過量表達能夠抑制煙草幼苗根系的生長發(fā)育。

3.5 過表達PsnHB13煙草植株花的觀察

當轉(zhuǎn)基因煙草處于生殖生長期時，發(fā)現(xiàn)過表達PsnHB13基因煙草的花出現(xiàn)表型差異。即與野生型相比，高表達的轉(zhuǎn)基因植株花朵整體上均呈現(xiàn)顯著變小的差異變化，而且雌蕊較雄蕊生長快(見圖6:A～C)，PsnHB13基因高表達煙草無法自花授粉，出現(xiàn)敗育現(xiàn)象。

4 討論

研究發(fā)現(xiàn)，HB13基因具有一些保守結(jié)構(gòu)域，如HD-Zip結(jié)構(gòu)域、CTR區(qū)、NTR區(qū)等。其中HD-Zip結(jié)構(gòu)域負責結(jié)合DNA二聚體化，CTR和NTR區(qū)域通過控制磷酸化與泛素化對轉(zhuǎn)錄激活功能進行調(diào)節(jié)[10]。其中，關(guān)于CTR上AHA結(jié)構(gòu)域的研究比較深入，AHA結(jié)構(gòu)域負責激活轉(zhuǎn)錄，該結(jié)構(gòu)域會形成一個帶負電荷的兩性分子，通過改變蛋白的螺旋結(jié)構(gòu)使其接觸基礎轉(zhuǎn)錄復合物[18]。另外在大麥和豌豆中的研究顯示，HB13蛋白的CTR端的保守結(jié)構(gòu)可以增加基因與植物同源域DNA的結(jié)合親和力、影響植物的發(fā)育以及育性[19～21]。以往對蛋白結(jié)構(gòu)的研究多集中在其核心結(jié)構(gòu)域，但越來越多的研究顯示，其他功能未知的結(jié)構(gòu)可能對蛋白行使功能具有更直接的調(diào)節(jié)作用，需要更深入的研究探討。

煙草以其結(jié)構(gòu)簡單、相似性高、生長周期短等特點作為模式植物之一，可以彌補楊樹生長周期較長這一主要因素，從而可以在短時間內(nèi)較為真實地驗證基因的生理生化功能。本實驗在煙草中異源表達小黑楊PsnHB13基因初步探究基因功能。與野生型相比，過量表達PsnHB13的轉(zhuǎn)基因煙草的葉片長寬比明顯增加，葉片變小，早期幼苗根系明顯變短，植株花朵整體上變小。這可以為推測該基因在楊樹中的功能提供一定的參考，該基因可能對楊樹的葉型，葉片大小以及根系長度等方面產(chǎn)生影響。

植物葉片是光合作用的主要器官之一，葉片性狀特征變化將直接影響到植物的基本行為及生態(tài)功能的發(fā)揮[22]。近年來，關(guān)于葉片性狀的研究已逐漸成為植物生態(tài)學領(lǐng)域新的研究熱點[23]。研究表明，植物單位質(zhì)量的葉面積越大，生產(chǎn)力就會越高[24]。而根系是植物的主要吸收器官，植物依靠根系從土壤中吸收水分和營養(yǎng)物質(zhì)[25～26]。能否通過在楊樹中敲除或過表達一些基因，使樹木在生長發(fā)育過程中葉片變大，根系生長加快，提高生產(chǎn)力促進營養(yǎng)生長從而縮短楊樹育種周期是個亟待解決的問題。HB13作為一個生長負調(diào)控因子，在楊樹中敲除該基因，以期獲得具有優(yōu)良性狀的優(yōu)勢樹種。然而，PsnHB13基因是否是小黑楊生長發(fā)育的決定性基因以及通過怎樣的方式調(diào)控楊樹營養(yǎng)器官與生殖器官的發(fā)育以及形態(tài)變化仍需進一步深入的探究，挖掘其潛在的學術(shù)與應用價值。