富集自體骨髓間質干細胞在兔椎間關節融合中的應用研究

甘維 朱柔霖 劉雪萍

[摘要] 目的 探討富集自體骨髓間質干細胞在兔椎間關節融合中的應用效果。 方法 選取健康10周齡的新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機取新西蘭大白兔24只，設為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術，建立新西蘭大白兔動物模型。建模成功后隨機分為1組（n=24）、2組（n=24）、3組（n=24）。1組建模成功后不采取任何措施處理，常規飲食、飲水;2組給予纖維蛋白膠、骨形態發生蛋白干預;3組在2組基礎上聯合富集自體骨髓間質干細胞移植干預，比較四組大白兔第12周時階段活動程度、四組大白兔椎體后緣高度丟失情況、椎間關節融合情況、X線側位片上測量Cobb角情況。 結果 1組關節活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節活動范圍與活動度相比，無明顯差異（P>0.05），4組關節活動范圍與活動度最差;四組大白兔椎體后緣高度丟失情況相比，無明顯差異（P>0.05）;1組椎間關節融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關節融合分級最差;四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05）。 結論 兔椎間關節融合中，富集自體骨髓間質干細胞移植效果顯著，可以有效促進兔椎間關節融合，應在臨床上廣泛推廣與應用。

[關鍵詞] 富集自體骨髓間質干細胞;兔椎間關節融合;骨形態發生蛋白;纖維蛋白膠;椎體后緣高度

[中圖分類號] R687.4? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2020）13-0031-05

[Abstract] Objective To explore the application effect of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells in the rabbit intervertebral joint fusion. Methods Ninety-six healthy New Zealand rabbits aged 10 weeks were selected of either sex. Twenty-four New Zealand rabbits were randomly selected as the blank control group（group 4）. The remaining 72 New Zealand rabbits were given extraperitoneal lumbar discectomy and spinal fusion via the anterior approach， and the animal model of New Zealand rabbits was established. Those rabbits were randomly divided into group 1（n=24）， group 2（n=24） and group 3（n=24） after modeling. No intervention was given to group 1 after modeling， which was fed with regular diet and drinking water; the intervention of fibrin glue and bone morphogenetic protein was given to group 2; the intervention of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells was given to group 3 on the basis of group 2. At 12 weeks， the activity level， the loss of height of vertebral posterior margin， the intervertebral joint fusion， and the measured Cobb angle on the lateral X-ray were compared in the four groups. Results The range of joint activity and the activity level in the group 1 were lower than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; there was no significant difference in the range of joint activity or the activity level between group 2 and group 3（P>0.05）; the range of joint activity and the activity level in group 4 were lower than those in the other three groups. There was no significant difference in the loss of height of vertebral posterior margin among the four groups（P>0.05）. The grade of the intervertebral joint fusion in the group 1 were higher than those in group 2， group 3 and group 4（P<0.05）; There was no significant difference in the grade of the intervertebral joint fusion between group 2 and group 3（P>0.05）; The grade of the intervertebral joint fusion in group 4 was lower than that in the other three groups. There was no significant difference in the Cobb angle among the four groups（P>0.05）. Conclusion In the rabbit intervertebral joint fusion， the transplantation of enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells has significant effect and can effectively promote the rabbit intervertebral joint fusion， which should be widely popularized and applied in clinical medicine.

[Key words] Enriched autologous bone marrow mesenchymal stem cells; Rabbit intervertebral joint fusion; Bone morphogenetic protein; Fibrin glue; Height of vertebral posterior margin

脊柱融合術在臨床上是治療脊柱畸形、椎體滑脫、脊柱退變性疾病的常用方法。融合材料一般為人工骨、自體骨、異體骨[1]。植入的這些材料體積較大，需要對機體組織進行破壞才能獲得較好的手術視野，且術后并發癥較多，治療費用偏高。因此，尋找更加安全、有效、生物活性高的植骨替代材料非常重要。自體髂骨移植是臨床上進行脊柱融合的首選方法，但是，有5%～35%的患者會發生單節段脊柱不融合現象，多節段脊柱融合骨不連發生率也非常高，同時，會有30%的患者發生神經損傷、切口感染、血腫、疼痛等癥狀，這會延長手術時間、增加出血量[2]。有相關研究顯示，富集自體骨髓間質干細胞（BMSCs）經過骨形態發生蛋白的誘導可以產生成骨細胞[3]。我院在兔椎間關節融合研究中，使用富集自體骨髓間質干細胞（BMSCs）進行移植，效果顯著，現報道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取健康10周齡的新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機取新西蘭大白兔24只，設為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術，建立新西蘭大白兔動物模型。建模成功后隨機分為1組（n=24）、2組（n=24）、3組（n=24）。新西蘭大白兔96只，體重1.5～2.5 kg，平均（1.96±0.22）kg;動物許可證號：SYXK（粵）2019-0201，所選動物均由中山大學醫學院動物實驗中心提供雄性C57BL/6小鼠常規飼養，自由攝食、飲水，光照12 h，建模前12 h禁食。

1.2 儀器與設備

無菌液態bBMP：廣州陸軍總院;凝血酶抑肽酶、纖維蛋白原：哈爾濱翰邦公司;胰蛋白酶、DMEM培養基、胎牛血清（FBS）：美國Gibco公司。

1.3 方法

1.3.1 骨髓基質干細胞、bBMP、FG復合載體及富集自體骨髓間質干細胞（BMSCs）、FG復合物制備? （1）bBMP、FG復合載體制備。嚴格無菌條件下將液態bBMP溶液、混合纖維蛋白膠溶液加入纖維蛋白膠抑胰肽酶溶液中聚合而成的FG，最終的bBMP濃度：20 ms/mL，將FG注射到24支無菌離心管內，放置在4℃條件下進行保存[6]。另外再取24支離心管，在其中加入FG，放置在4℃條件下保存。（2）骨髓基質干細胞制備。對選取的每組大白兔各耳朵打孔作為標志，將4 mL骨髓從脛骨粗隆處抽取出來，然后將S液、D-Hank液加入其中混合均勻，將細胞懸液按照1∶1.5的比例進行密度梯度離心[4]。小心的對中間細胞層（富含有核細胞、骨髓基質細胞）吸取，使用D-Hank、S液對細胞進行吹打洗滌，將分離液清除，將細胞液分為3份分別加入含有DMEM的培養液（10 ms/L谷胺酰胺、20%胎牛血清）中進行培養，1周后換溶液，之后定期更換，每3天1次，直到整個培養孔底面鋪滿貼壁細胞[5]。消化傳代過程中將胰酶充分利用起來，同時記錄細胞計數。（3）FG、BMSCs復合物制備。在紫外線下放置FG，照射1 h消毒，分別加入各白兔培養的傳代3次內的BMSCs懸液，混合，標記[7]。離心細胞，將上清液去除，使其在膠原-bBMP-DMEM和膠原-DMEM混合液中懸浮，調整細胞濃度為5×106/mL[8]。

1.3.2 動物模型建立及方法? （1）新西蘭大白兔建模方法。新西蘭大白兔96只，雌雄不限，隨機取新西蘭大白兔24只，設為空白對照組（4組）。剩余72只新西蘭大白兔均經前路腹膜外行腰椎間盤切除脊柱融合術，建立新西蘭大白兔動物模型，具體建模方法如下：對新西蘭大白兔準確稱重，給予其靜脈注射氯胺酮麻醉，無菌操作下將長度為10 cm的手術切口縱行開在左側腰大肌前緣，向腹膜進入后鈍性分離，將橫突充分暴露出來，然后將腹膜、腰大肌推開，方向為沿著橫突前方，之后將椎旁肌推開，方向為沿著橫突后方，并達到橫突根部，將橫突咬斷，充分暴露L5-6、L4-5、L3-4椎間盤與椎體;用銳刀從側方切開椎間盤纖維環，將椎間盤前后纖維環保留下來。用刮匙將部分軟骨終板、椎間盤刮出，打磨后將軟骨終板去除，打磨過程中將梭形小磨鉆充分利用起來，將骨性中板充分暴露出來，刮匙輔助下對椎間盤殘留髓核、軟骨情況進行觀察。用椎間盤撐開器將椎間隙撐開，從而建立新西蘭大白兔椎間關節融合動物模型。（2）動物干預方法。1組建模成功后不采取任何措施處理，常規飲食、飲水;2組給予纖維蛋白膠、骨形態發生蛋白干預，每盤注射0.08～0.10 mL凝膠，止血完全后縫合切口;3組在2組基礎上聯合富集自體骨髓間質干細胞移植干預，每盤注射0.08～0.10 mL凝膠，3組、2組新西蘭大白兔注射1次即可，止血完全后縫合切口[10]。術后為大白兔注射40萬U青霉素，2次/d。連續注射3 d，常規喂食，不限制其活動[11]。

1.4 觀察指標

（1）比較四組大白兔第12周時階段活動程度。（2）比較四組大白兔椎體后緣高度丟失情況。（3）比較四組大白兔椎間關節融合情況，融合情況通過影像學進行評估，采用Lenke字母分級法，骨融合：A級～B級;可疑融合或無融合：C級～D級[12]。（4）比較四組大白兔X線側位片上測量Cobb角情況，通過X線片檢查對Cobb角進行測量[13]。

1.5 統計學方法

采用SPSS21.0統計學軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，采用t檢驗;計數資料以[n（%）]表示，采用χ2檢驗。檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1四組大白兔第12周時階段活動程度比較

1組關節活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節活動范圍與活動度相比無明顯差異（P>0.05），4組關節活動范圍與活動度最差，見表1。

2.2四組大白兔椎體后緣高度丟失情況比較

四組大白兔椎體后緣高度丟失情況比較，無明顯差異（P>0.05），見表2。

2.3四組大白兔椎間關節融合情況比較

1組椎間關節融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關節融合分級最差，見表3。

2.4 四組大白兔Cobb角情況比較

四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05），見表4。

3討論

骨髓間質干細胞屬于一種骨髓細胞，具有較多的功能，如自我增殖、多向分化功能等，可以誘導成骨細胞分化與生長。由于該細胞收集比較簡單，且培養方法簡單便捷，已經在臨床上廣泛用于骨折與骨缺損重建與修復，同時在脊柱融合中也應用較為廣泛[14]。在實際的使用期間需要為骨細胞生長、增殖、分化提供良好前提條件的因子和支架。因此，臨床很有必要將合適的生長因子和支架材料尋找出來。

骨形態發生蛋白（bBMP）是一種局部因子，能夠為骨組織生長、形成提供良好的前提條件，提取主體為牛骨，該因子的生物作用主要為：（1）募集間充質細胞，對成軟骨細胞、成骨細胞分化進行誘導;（2）對其他因子進行誘導，使其在骨形成過程中參與。但是，bBMP需要依賴骨髓基質干細胞、骨系細胞才能將促骨生長作用發揮出來，且成肌細胞、成纖維細胞在BMP的協助下可以轉化為骨系細胞[15]。有學者研究發現，將BMP注入到兔椎關節中，可以發現椎間關節融合。還有學者研究發現，將富集自體骨髓間質干細胞移植（BMSCs）、纖維蛋白膠、骨形態發生蛋白結合用于兔椎關節融合中，可以有效促進椎關節融合[16]。本研究顯示，1組椎間關節融合分級高于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節融合分級相比，無明顯差異（P>0.05），4組關節融合分級最差，說明在兔椎間關節融合中，富集自體骨髓間質干細胞移植效果顯著，該融合與周圍肌肉韌帶血供比較豐富有很大的關系。

脊柱融合是臨床上治療脊柱相關疾病的主要方法。自體髂骨移植是臨床進行脊柱融合的首選方法，但是很多患者會發生不良的癥狀。自體骨髓間質干細胞在人體各個部位中的骨髓中均存在，在整個骨髓有核細胞占0.001%～0.01%，一般臨床上使用以下方法收集骨髓間質干細胞：（1）免疫磁珠分選法;（2）流式細胞儀分離法;（3）密度梯度離心法;（4）貼壁分離篩選法[17]。免疫磁珠分選法與流式細胞儀分離法對細胞的活性會產生很大的影響，甚至會使細胞活性喪失，且操作方法比較復雜，因此限制了一定的臨床使用。貼壁法簡單便捷，但是獲取細胞的方法比較復雜，細胞的純度也較差，尤其對于細胞純度要求高的工作將其作為主要方法是不合適的[18]。密度梯度離心法是當前臨床上分離、純化骨髓間質干細胞的主要方法，該方法效果較好。有相關研究顯示，骨髓間質干細胞在體外一定環境下進行誘導、培養可以分化、擴增成骨細胞[19]。最近幾年臨床上通過富集自體骨髓間質干細胞促進兔椎間關節融合中，獲得了較好的效果。而在此過程中應用密度梯度離心法有效提高了細胞的純化程度[20]。

FG主要形成于凝血反應發生的最后階段，結合纖維蛋白原凝血酶能夠促進纖維蛋白單體的形成，最終聚合三維立體結構FG。FG具有較好的細胞可塑性、相容性，在生物工程載體中較為常用。在對MSCs和FG進行體外復合培養的實驗過程中，發現MSCs能夠生長于材料表面，同時會逐漸黏附，細胞在不斷延長的培養時間下會逐漸長到孔隙中。有學者研究發現，FG可以作為成骨細胞的支架，體外培養后向兔脊柱骨缺損部位植入。術后X線檢查、組織學檢查發現，有新骨形成于骨缺損部位，同時無炎癥反應、排斥反應發生。而新生的骨組織說明FG不會對MSCs的分化與增殖造成影響。

本研究顯示，1組關節活動范圍與活動度低于2組、3組、4組（P<0.05），2組、3組關節活動范圍與活動度相比，無明顯差異（P>0.05），4組關節活動范圍與活動度最差，這就說明，在兔椎間關節融合中，富集自體骨髓間質干細胞移植效果顯著，可以更好地促進兔椎間關節活動范圍與活動度恢復，兔椎間關節融合效果顯著。

本研究顯示，四組大白兔椎體后緣高度丟失情況相比，無明顯差異（P>0.05），四組大白兔Cobb角相比，無明顯差異（P>0.05），說明在兔椎間關節融合中，富集自體骨髓間質干細胞移植對于椎體后緣高度、Cobb角的影響較小，與纖維蛋白膠、骨形態發生蛋白的效果相比，無明顯差異，但是，富集自體骨髓間質干細胞移植在促進兔椎間關節活動情況與融合中發揮重要的作用。

綜上所述，兔椎間關節融合中，富集自體骨髓間質干細胞移植效果顯著，可以有效促進兔椎間關節融合，促進兔椎間關節活動范圍與活動度恢復，因此，應在臨床上廣泛推廣應用。

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（收稿日期：2019-10-23）