衍生物Fla-CN 的抗糖尿病作用及其作用機制研究

寇川，梁艷，張暢，秦楠，段宏泉，陳瑩

（天津醫科大學藥學院天然藥物化學系，天津300070）

糖尿病的發病原因錯綜復雜，但是臨床上都具有一個共同特征：血糖的病理性升高。慢性高血糖癥導致易感組織的病理損傷，并可能最終導致繼發性并發癥，如視網膜病變、腎病和神經病變、心血管疾病和卒中[1-3]。通常，胰島素的釋放減少和作用受到抑制會導致糖異生作用增加，糖攝取降低，從而導致血糖水平升高。肝臟在維持2 型糖尿病的葡萄糖穩態中起重要作用。當血糖升高時，肝臟會增強肝臟對葡萄糖的吸收，吸收糖原存儲，合成脂肪酸并改善胰島素敏感性。因此，改善肝葡萄糖代謝穩態可能是治療2 型糖尿病的潛在策略。

3-O-[（E）-4-（4-cyanophenyl）-2-oxobut-3-en-1-yl] kaempferol（Fla-CN）是委陵菜黃酮Tiliroside 的衍生物，通過激活AMP 活化蛋白激酶（AMPK），增強HepG2 細胞的葡萄糖消耗[4]。本課題組以高脂飲食誘導的肥胖小鼠模型為研究對象，發現Fla-CN不僅具有抗肥胖作用，而且可提高肥胖小鼠的胰島素敏感性[5]。糖尿病C57BL/KsJ-db/db 小鼠是瘦素受體基因突變導致的，是目前廣泛應用于研究人類2型糖尿病的動物模型之一[5-6]。本研究旨在以2 型糖尿病模型db/db 小鼠為研究對象，評價Fla-CN 對糖代謝的調節作用及其機制。

1 材料和方法

1.1 黃酮衍生物Fla-CN 化合物Fla-CN 的結構（圖1）通過1H、13C NMR 和2D NMR 波譜數據分析確定，包括COSY、HSQC、HMBC 和ROESY 光譜。通過HPLC 分析Fla-CN 的純度≥95%。

圖1 Fla-CN 的化學結構Fig 1 The chemical structure of Fla-CN

1.2 細胞培養 人肝癌細胞株HepG2 細胞購自美國模式培養物集存庫（ATCC）。細胞培養于10%胎牛血清100 IU/mL 青霉素、0.1 mg/mL 鏈霉素的α-MEM 培養基中，置CO2培養箱中，于37℃、5%CO2條件下培養。在顯微鏡下觀察、計數，根據實驗需要，調整細胞密度，接種于培養瓶或培養板中，同樣條件下繼續培養，待細胞融合形成連續單層后即可用于實驗。

1.3 葡萄糖生成測定 取對數生長期的HepG2 細胞接種于6 孔板，細胞密度為2×105個細胞/孔，培養24 h 后，棄去原培養基，PBS 洗2 次，更換為無血清培養基，加入Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及二甲雙胍（1 mmol/L），同時設立空白對照組，孵育24 h。用PBS 洗滌兩次以除去葡萄糖，然后更換葡萄糖生成測定培養基（含有1 mmol/L 丙酮酸鈉，20 mmol/L乳酸鈉和15 mmol/L HEPES 的無葡萄糖和酚紅的DMEM），溫育4 h[7-8]。使用Amplex Red Glucose /葡萄糖氧化酶測定試劑盒（Sigma，St.Louis，USA），取上清液用于測量葡萄糖濃度。通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定細胞蛋白濃度。

1.4 葡萄糖攝取測定 取對數生長期HepG2 細胞以3×105個細胞/孔的密度接種到6 孔板中，待12 h貼壁后，加入不同濃度Fla-CN，預留空白對照組、陽性對照組（Ins 組）。24 h 后，PBS 洗3 遍，更換為無糖無血清的DMEM 培養基饑餓3 h，PBS 洗2 遍，每孔加入300 μL 的無糖無血清DMEM 培養基，同時加入1.5 μL 濃度為20 mmol/L 的2-NBDG，陽性對照組加入100 nmol/L 短效人胰島素，作用30 min。實驗結束，消化細胞，收集細胞至Ep 管中，5 000 r/min（離心半徑6.2 cm）4℃離心5 min，小心吸棄上清液，同時加入200 μL PBS 重懸細胞沉淀，于熒光酶標儀激發波/發射波為488/520 nm 的條件下讀取數值。

1.5 糖原含量測定 將對數生長期HepG2 細胞接種到6 孔板中，待12 h 貼壁后，吸棄舊培養基，PBS洗2 遍，每孔分別加入無血清高糖DMEM 培養基以及Fla-CN（1、2、5 和10 μmol/L）及胰島素（100 nmol/L），24 h 后吸棄上清液，消化細胞，收集細胞，在30%KOH 中勻漿。將樣品煮沸20 min，加入1.5 mL 乙醇，然后以12 000 r/min（離心半徑6.2 cm）離心15 min。將沉淀物溶于0.5 mL 蒸餾水中，并加入0.2%的蒽酮（用98%的硫酸稀釋）稀釋后煮沸20 min。在620 nm 處檢測并記錄OD 值，通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定細胞蛋白濃度。

1.6 動物與干預 C57BL/KsJ-db/db 和C57BL/KsJ-db/m 雄性小鼠42 只，SPF 級，6～8 周齡，由南京大學模型動物研究中心提供[批號：SCXK（蘇）2018-0008]。小鼠飼養于天津市南開醫院動物實驗中心[飼養許可證號：SYXK（津）2015-0007]，按照SPF 飼養標準適應性喂養1 周，期間自由進食、進水。1 周后稱重并按照隨機數字表法隨機分組。以C57BL/KsJ-db/m 小鼠為對照組，灌胃給予生理鹽水（db/m）。C57BL/KsJ-db/db 小鼠根據體重和血糖水平按照隨機數字表法隨機分為不同的治療組。為期4 周的研究分組如下：db/db（生理鹽水溶液）、Fla-CN 高劑量組（Fla-CNH）、中劑量組（Fla-CNM）及低劑量組（Fla-CNL），給藥劑量分別為15 mg/kg、8 mg/kg、2.3 mg/kg，陽性對照組給予鹽酸二甲雙胍150 mg/kg。灌胃，每天1 次。在研究結束時，所有小鼠禁食12 h。在處死之前收集空腹血液以測量空腹血糖。將組織和血清保持在-80℃直至進一步分析。

1.7 口服葡萄糖耐量試驗（OGTT）和腹腔內胰島素耐量試驗（IPITT） 禁食過夜的動物在第12 周末通過口服2 g/kg 葡萄糖進行OGTT，固定小鼠，75%醫用酒精對尾部消毒后，剪尾0.5 mm 讓血液自然滴于血糖試紙上，測量空腹血糖水平，記為OGTT 試驗0 min 血糖水平。給予20%葡萄糖灌胃后，記錄小鼠在30、60、90 和120 min 血糖水平，繪制血糖曲線，計算血糖-時間曲線下面積。

IPITT 在間隔3 d 后進行。小鼠禁食2 h，鼠尾取血記錄血糖水平，記為0 min 血糖水平，腹腔注射0.75 IU/kg 人短效胰島素。胰島素注射后記錄30、60、90 和120 min 血糖濃度。繪制血糖曲線，計算血糖-時間曲線下面積。

1.8 免疫印跡 細胞達到匯合后，將培養基替換為補充有0.2%BSA 的DMEM。12 h 后，除去培養基，并加入含有不同濃度的Fla-CN 和（或）20 μmol/L AICAR 和（或）20 μmol/L compound C 的培養基。孵育24 h 后，使用蛋白質提取試劑盒提取總蛋白質和核蛋白。將肝組織在含有蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑的冰冷RIPA 緩沖液中勻漿。將組織勻漿離心[13 000 r/min（離心半徑6.2 cm），20 min，4℃]，并將上清液用于蛋白質印跡分析。通過Thermo Scientific BCA 蛋白測定試劑盒測定蛋白濃度。通過10%十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）分離蛋白質樣品（60 μg/泳道），并轉移至PVDF 膜（Millipore，Bedford.MA）。將膜用含10%脫脂奶粉的的TTBS 封閉1 h，并在4℃下與磷酸化AMPK、磷酸化乙酰輔酶A 羧化酶（p-ACC）、磷酸烯醇式丙酮酸羧激酶（PEPCK），葡萄糖-6-磷酸酶（G6Pase）、過氧化物酶體增殖物激活受體γ 協同刺激因子1α（PGC-1α）、AMPK 和β-肌動蛋白（β-actin）孵育過夜。TTBS 洗3 次，每次10 min。之后，辣根過氧化物酶耦聯的二抗孵育1 h。通過使用增強的化學發光Western 印跡檢測系統（GE Healthcare Life Sciences，英國）對條帶進行可視化。應用NIH Image J 軟件分析，進行定量分析。所有抗體均購自Cell Signaling Technology。

2 結果

2.1 Fla-CN 對肝HepG2 細胞糖代謝的影響 如圖2A 所示，研究首先觀察了Fla-CN 對HepG2細胞中葡萄糖攝取的影響。HepG2 細胞分別與Fla-CN（1、2.5、5、12.5 μmol/L）以及胰島素（100 nmol/L）孵育后，與對照組相比，5、12.5 μmol/L 的Fla-CN以及胰島素均顯著增加了肝細胞對2-NBDG 的攝取（F=33.50，P＜0.01）。

研究通過蒽酮法測定HepG2 細胞內糖原含量，結果如圖2B 所示，與對照相比，胰島素刺激后HepG2細胞內的糖原含量顯著增加。不同濃度的Fla-CN孵育的HepG2 細胞內糖原含量呈劑量依賴性增加，其中濃度分別為5、12.5 μmol/L（F=93.63，P＜0.01）的Fla-CN 明顯提高細胞內的糖原含量。

Fla-CN 呈劑量依賴性的抑制肝葡萄糖產生（F=44.19，P＜0.01，圖2C）。同時Fla-CN 對HepG2細胞內乳酸含量無顯著影響（數據未顯示）。

圖2 Fla-CN 對肝細胞HepG2 細胞內糖攝取、糖原合成以及糖異生過程的影響Fig 2 Effect of Fla-CN on hepatic glucose uptake,glycogen synthesis and gluconeogenesis in HepG2 cells

2.2 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服糖耐量和胰島素耐量的影響 如圖3A 所示，在實驗結束時，模型組db/db 小鼠的空腹血糖明顯高于對照組db/m 小鼠。與模型組相比，Fla-CNH 組空腹血糖水平顯著降低（t=3.853，P＜0.05）。在OGTT（圖3B）和IPITT（圖3D）中，Fla-CN 干預組各個時間點血糖濃度均低于該時間點模型組的血糖濃度。在OGTT 中，與db/m 相比，模型組db/db 的曲線下面積顯著增加（t=104.6，P＜0.001）；而與db/db 組相比，Fla-CNH 組和二甲雙胍組（F=98.40，P＜0.05）曲線下面積則明顯降低（圖3C、E）。

圖3 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖、口服葡萄糖耐量實驗及其時間-血糖曲線下面積、胰島素耐量實驗及其時間-血糖曲線下面積的影響Fig 3 Effects of Fla-CN on fasting blood glucose,oral glucose tolerance and its AUC,insulin tolerance and its AUC in mice

2.3 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織AMPK 磷酸化的影響 如圖4 所示，與db/db組相比，不同劑量Fla-CN 均上調db/db 小鼠肝臟組織和肌肉組織中磷酸化AMPK 蛋白表達，并呈現濃度依賴性。同時，各給藥組小鼠肝組織和肌肉組織中AMPK的總水平沒有顯著變化。故與2 型糖尿病模型db/db組相比，肝臟組織Fla-CN 與二甲雙胍治療組的磷酸化AMPK/AMPK 比例明顯提高（F=134.7，P＜0.01），在肌肉組織中也觀察到Fla-CN 與二甲雙胍治療組磷酸化AMPK/AMPK 比例顯著提高（F=40.47，P＜0.05）。

圖4 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織中AMPK 磷酸化的影響Fig4 Effect of Fla-CN on AMPK phosphorylation in liver and muscle of db/db mice

2.4 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝組織糖異生的影響 Western 印跡（圖5）結果顯示，db/db 組中PEPCK（t=51.53，P＜0.001）、G6Pase（t=19.47，P＜0.001）的蛋白表達顯著增加，PGC-1α 的蛋白表達也明顯升高（t=36.95，P＜0.001）。而Fla-CN 則明顯抑制PEPCK（F=54.20，P＜0.001）、G6Pase（F=36.79，P＜0.001）和PGC-1α（F=44.78，P＜0.05）的蛋白表達。

2.5 Fla-CN 通過AMPK 激活抑制糖異生 為了確認衍生物Fla-CN 是否通過激活AMPK 調節糖異生過程，實驗采用Fla-CN（12.5 μmol/L）結合AMPK抑制劑Compound C（4 μmol/L）和激活劑AICAR（0.1 mmol/L）處理HepG2 細胞。如圖6A 所示，Fla-CN 顯著增加了AMPK 的磷酸化，這種作用被Compound C 阻斷。Fla-CN 和AICAR 都顯著下調了HepG2 細胞中PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的蛋白表達。此外，與Fla-CN 組相比，Fla-CN 和Compound C共同孵育對PEPCK（t=24.82，P＜0.01）、G6Pase（t=4.673，P＜0.05）和PGC-1α（t=10.58，P＜0.01）的抑制作用減弱。

圖5 Fla-CN 對2 型糖尿病db/db 小鼠肝組織糖異生過程中G6Pase,PEPCK and PGC-1α 蛋白表達的影響Fig 5 Effect of Fla-CN on the protein expression of G6Pase,PEPCK and PGC-1α in the liver of db/db mice

圖6 Fla-CN 通過AMPK 信號通路對肝糖異生的抑制作用Fig 6 Fla-CN exerts an inhibitory effect on hepatic gluconeogenesis via the AMPK signaling pathway

3 討論

血糖穩態是機體通過調節內源性葡萄糖的產生以及對胰島素敏感的外周組織的葡萄糖攝取來實現的。正常機體攝食后，胰島素抑制肝臟中糖異生和糖原分解，并增強周圍組織對血液中葡萄糖的利用，如糖原合成、糖酵解等。然而，在2 型糖尿病患者體內，肝臟的糖異生明顯增加、糖原合成降低；血液中葡萄糖的攝取作為骨骼肌、肝臟等組織對葡萄糖利用的起始，在機體胰島素抵抗情況下受到抑制[10]。這些變化導致葡萄糖的生成率超過血液循環中葡萄糖的清除率，引起血液循環中血糖升高[11]。近年來，在對2 型糖尿病的藥物研發中，尋找能夠調節葡萄糖代謝、恢復血糖穩態的活性天然產物已經成為治療2 型糖尿病藥物研發的熱點。據報道，小檗堿[12]、山奈酚[13]、人參皂甙[7,14]等能夠抑制肝葡萄糖生成，促進葡萄糖攝取而表現出降血糖的作用。本研究發現，黃酮衍生物Fla-CN 在一定濃度范圍內能夠顯著增加肝HepG2 細胞對葡萄糖的攝取，抑制糖異生，促進糖原合成，提示Fla-CN 在調節糖代謝中具有重要作用。體內實驗進一步顯示，Fla-CN 能夠明顯降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善db/db 小鼠受損的糖耐量和胰島素耐量，這些結果證明Fla-CN 具有顯著調節葡萄糖穩態，有效提高胰島素敏感性，改善胰島素抵抗的作用。

AMPK 是一種絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶，是由α、β 和γ 亞基組成的異源三聚體，能夠維持細胞能量平衡。外周組織如骨骼肌、肝臟和脂肪組織中AMPK 的激活能夠加快新陳代謝，改善胰島素敏感性，有利于2 型糖尿病的預防和治療。AMPK 復合物不僅可以感知細胞中AMP 和ATP 的比例，而且細胞內糖原含量的改變可影響AMPK 的活性，所以AMPK 被認為是細胞能量代謝狀態和能量儲備狀態的感受器[15]。骨骼肌是機體餐后攝取葡萄糖的主要器官，能夠攝取80%餐后升高的血糖，對維持血糖穩態發揮重要作用。研究表明，葡萄糖的攝取必須借助跨膜蛋白葡萄糖轉運蛋白（GLUT）的轉位來完成。目前已經發現的GLUT 有14 種，分別是GLUT 1～14，這些GLUTs 分布在機體不同組織。其中由SLC2A4 基因編碼的GLUT4 是細胞葡萄糖攝取率的決定因素，它與2 型糖尿病的代謝異常密切相關。激活的AMPK 可以導致其底物AS160 磷酸化，降低AS160 的Rab-GTP 酶活性，刺激GLUT4 由細胞內轉位至細胞膜，促進葡萄糖的攝取[16-17]。降糖藥物二甲雙胍作為臨床一線藥物，通過促進外周組織對葡萄糖的攝取和利用，維持血糖穩定。研究發現，二甲雙胍是一種AMPK 激動劑，主要通過激活AMPK 發揮其降糖作用[18-19]。本研究結果顯示，Fla-CN 處理后顯著增加了糖尿病db/db 小鼠肝臟和肌肉組織中AMPK 的磷酸化，表明Fla-CN 可能通過激活AMPK 促進葡萄糖攝取。

另一方面，肝臟中AMPK 的激活可有效抑制糖異生關鍵酶PEPCK 和G6Pase 的表達，進而抑制肝臟糖異生，降低葡萄糖生成[20]。而肝AMPK 特異性敲除小鼠后顯示糖耐量受損以及空腹高血糖，這可能是由于PEPCK 和G6Pase 活性增加，從而肝臟糖異生增加[21]。PGC-1α 是一種轉錄共激活因子，參與調節細胞能量代謝的多個方面，在1 型和2 型糖尿病中，PGC-1α 的基因表達水平均顯著升高。由腺病毒介導在大鼠肝臟過表達PGC-1α，其原代肝細胞和禁食動物肝臟中觀察到激活的PGC-1α 參與糖異生的整個過程。重要的是，在原代肝細胞中觀察到葡萄糖分泌增加，而大鼠禁食后體內葡萄糖水平升高[22]。因此，肝臟中PGC-1α 活性升高很可能導致糖尿病的高血糖癥。最近的研究表明，PGC-1α 也是肝細胞核受體4α（HNF4α）和叉頭框蛋白O1（FOXO1）的輔激活因子，調控糖異生關鍵酶PEPCK 和G6Pase 的活性[23-25]。有研究報道，AMPK 可能導致共激活因子PGC-1α 的表達下調，進而抑制PEPCK 和G6Pase 的表達[9]。在本研究中，2 型糖尿病小鼠的肝組織和HepG2 肝細胞中，Fla-CN 顯著激活AMPK，同時抑制PEPCK、G6Pase 和PGC-1α 的表達，這可能是Fla-CN 降低db/db 小鼠空腹血糖，抑制肝細胞糖異生的作用機制。為了進一步證實AMPK 在Fla-CN調節糖異生過程的作用，研究采用AMPK 抑制劑（Compound C）來阻斷Fla-CN 誘導的AMPK 活化作用。筆者發現Compound C 可以阻止AMPK 的活化，并且削減了Fla-CN 對PEPCK、G6Pase 和PGC-1α蛋白表達的抑制作用，表明AMPK 在Fla-CN 的調控糖異生過程機制中起關鍵作用。

本研究表明，黃酮衍生物Fla-CN 具有調節肝HepG2 細胞糖代謝的作用，并且能夠顯著降低2 型糖尿病db/db 小鼠空腹血糖，改善其受損的糖耐量，提高胰島素敏感度。進一步研究顯示，Fla-CN 可以通過激活AMPK 調節糖攝取和肝糖異生，從而發揮抗糖尿病作用。