8 周不同時間點有氧運動干預對腦卒中大鼠神經功能的影響

姜俐洋，史昱，黃傳，蘇悅，萬春曉

（1.天津醫科大學總醫院康復醫學科，天津300052；2.天津市海河醫院康復醫學科，天津300350）

腦卒中是全球第二大死亡原因和長期殘疾的首要原因，具有很大的社會和經濟負擔[1]。在美國，每年大約有795 000 人患腦卒中或復發性卒中，其中40%的人導致終身殘疾[1]。腦卒中后的有氧運動可以促進神經功能的恢復，提高患者的日常生活活動能力[2]。但腦卒中后的早期康復介入時間點仍然存在爭議。Li 等[3]發現卒中后6 h 開始運動會加劇細胞凋亡，而24 h 后運動并不會導致這種現象。相反，Humm 等[4]發現卒中后24 h 開始運動會導致皮質組織進一步損傷。其他動物實驗發現大鼠卒中后7 d開始運動會加劇大鼠運動皮質內前肢區域的損傷[5]。此外，早期運動中，只有輕度至中度運動可以促進卒中后大鼠恢復，而劇烈運動并不能改善卒中后功能[6]。這些研究共同強調了卒中后運動開始時間對損傷和身體殘疾康復的重要性。血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor, VEGF）參與調節缺血卒中后的一系列分子過程，如神經血管的重塑和修復、神經保護、神經發生等，使組織適應卒中后的狀態[7]。但早期不同時間介入的運動訓練是否可以調節VEGF 的表達，發揮保護神經的作用，目前少有研究證明。磁共振擴散張量成像（diffusion tensor image, DTI） 是磁共振成像（magnetic resonance imaging，MRI）的特殊形式，而各向異性分數（fractional anisotropy，FA）是DTI 的衍生參數，其量化了腦白質中水擴散的方向性程度，是局部微結構完整性的替代度量[8]。在單側大腦半球病變的疾病中，大多數研究都集中于患側FA/對側FA 的比值，即相對FA（relative FA，rFA）在預測神經恢復和運動恢復的作用[9]。本研究通過對大鼠進行腦卒中后1 d、1 周開始運動干預及靜息干預，觀察8 周干預對大鼠腦組織VEGF 蛋白表達、FA 值和神經功能評分的影響，探究腦卒中后不同時間點運動干預對神經功能的影響及其分子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 選取SPF 級雄性8~9 周Spra gue-Dawley（SD）大鼠（北京華阜康生物科技股份有限公司，許可證號：SCXK 京2014-0004）24 只，體重280~310 g。將大鼠隨機分為假手術組（SHAM 組）、靜息組（SED 組）、術后1 d 開始運動組（EX-1D 組）、術后1 周開始運動組（EX-1W 組），每組6 只。

圖1 實驗流程圖Fig 1 Experimental flow chart

1.2 大腦中動脈栓塞（middle cerebral ischemia occlusion, MCAO）再灌注模型制備 采用改良Longa線栓法制備左側MCAO 模型[10]。大鼠經10%水合氯醛（300 mg/kg 體重）腹腔注射麻醉后，鈍性分離和結扎左側頸總動脈和頸外動脈，向頸內動脈插入線栓（型號：2838-A4 北京西濃科技有限公司），深度1.8~2.0 cm。60 min 后取出線栓，建立MCAO 模型，手術總時長＜90 min，保持大鼠肛溫（37±0.5）℃。假手術組暴露動脈，但不插入線栓，其余損傷同上。24 h 進行Longa 評分，1~3 分者納入本實驗[10]。

1.3 跑臺訓練及實驗設計 運動組大鼠分別于造模后1 d 或1 周開始進行8 周運動，使用ZS-PT 小動物實驗跑臺（北京眾實迪創科技發展有限責任公司），角度0°，速度12 m/min，30 min/d。大鼠停留至跑臺末端時用軟毛刷刺激促使繼續運動，直至完成干預（圖1）。

所有動物入組前均行3 d 的行為學評分預適應和跑臺預適應，運動強度同前。排除標準：（1）預適應期間不能配合完成跑臺運動。（2）造模后死亡。（3）造模24 h 后Longa 分不滿足要求。

1.4 改良神經功能評分（modified neurological severity score, mNSS）測定 如前所述，采用mNSS 評分，分值為0~18 分，分值越大神經功能缺損越嚴重[11]。由同一實驗人員分別于造模后1 周及干預8 周后進行評定。

1.5 FA 值的測定 造模后1 周及干預8 周后對各組進行DTI 和T2WI 掃描（SIEMENS MagnetomVerio 3.0T MR）。大鼠麻醉后仰臥位固定。T2-SPACE 序列，層厚=0.4 mm，掃描層數72 層，TR=1 000 ms，TE=155 ms，采集次數2 次，FA=120°，FOV=60 mm×60 mm，矩陣=192×192；同一實驗人員在MRI 工作站采集和處理數據。根據大鼠腦圖譜選取同一層面（Bregma-1.08～-4.20 mm）患側受累內囊區域以及健側對應等面積區域為感興趣區測量FA 值，rFA=患側FA/健側FA。

1.6 VEGF 蛋白印跡檢測 提取距離腦梗區3～4 mm的圍梗死區腦組織總蛋白，采用BCA 試劑盒定量蛋白濃度。以β-Actin 作為等量蛋白質上樣對照，取60 μg 蛋白/泳道進行SDS-PAGE 凝膠電泳分離總蛋白，隨后100 V 恒壓將蛋白轉至硝酸纖維膜上，室溫下5%脫脂牛奶封閉1 h，分別加入VEGF（1:1 000，Abcam, UK）、內參β-Actin 抗體（1:1 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA），4°C 孵 育 過夜，加入辣根過氧化物酶標記的二抗（1:2 000，Cell Signaling Technology，Danvers，MA，USA）室溫孵育1 h，ECL 化學發光法通過凝膠電泳成像儀顯影。

1.7 統計學處理 數據用統計軟件SPSS22.0 和Graphpad Prism6.0 處理，本研究中定量資料經Shapiro-Wilks檢驗后，數據均滿足正態性，以(±s 表示。組間比較用方差分析，各組之間兩兩比較用LSD方法。各組VEGF 與mNSS、rFA值采用Pearson相關性分析。P＜0.05 為差異具有統計學意義。

2 結果

2.1 各組大鼠造模后1 周及干預結束后mNSS 評分的比較 在造模后1 周以及干預8 周后，對各組大鼠進行mNSS 評分。組內比較，SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組在8 周干預結束時的mNSS 評分均明顯降低（均P＜0.001）。各組組間比較中，在造模后1 周時，EX-1D 組大鼠mNSS 評分（8.17±1.169）分別明顯低于SED 組（9.67±0.817，P=0.023）、EX-1W 組（9.33±1.211，P=0.039）。干預8 周后，與SED 組（4.67±0.817）相比，EX-1D 組大鼠mNSS 評分明顯降低（2.67±0.817，P=0.002），而EX-1W 組沒有出現顯著變化（3.83±1.169，P=0.149）；與EX-1D 組比較，EX-1W 組大鼠mNSS 評分明顯升高（P=0.049，圖2）。

圖2 各組大鼠造模后1 周及各組分別干預8 周后mNSS 評分變化Fig 2 Variance in mNSS scores after one week of modeling and after 8 weeks of intervention in each group

2.2 各組大鼠造模后1 周及干預結束后rFA 值的比較 組內比較，各組與造模后1 周相比，SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組干預8 周后的rFA 值均明顯升高（均P＜0.001）。組間比較，在造模后1 周，EX-1D 組大鼠的rFA 值（0.37±0.039）較SED 組（0.30±0.656）明顯升高（P=0.049），而EX-1W 組與SED 組無明顯變化（P=0.408）。干預8 周后，與SED 組（0.48±0.090）相比，EX-1D 組（0.72±0.071）、EX-1W 組（0.62±0.076）大鼠rFA 值均顯著提高（均P＜0.001），且EX-1D 組rFA 值明顯高于EX-1W 組（P=0.005，圖3）。

圖3 各組大鼠造模后1 周及干預8 周后rFA 值變化Fig 3 Variance in rFA values after one week of modeling and 8 weeks after intervention in each group

2.3 各組大鼠干預結束后腦組織VEGF 蛋白表達的比較 干預8 周后，與SHAM 組（0.82±0.191）相比，SED 組大鼠VEGF 蛋白表達量（0.45±0.160）明顯降低（P=0.019），EX-1D 組（1.19±0.376）蛋白表達顯著升高（P=0.017），而EX-1W 組（0.91±0.206）蛋白未出現統計學差異（P=0.543）。與SED 組相比，EX-1D 組、EX-1W 組VEGF 蛋白表達量均明顯升高（PEX-1D=0.000，PEX-1W=0.005）。EX-1D 組的VEGF 表達略高于EX-1W 組，但無統計學差異（P=0.060，圖4）。

圖4 干預8 周后各組大鼠腦組織VEGF 蛋白表達Fig 4 VEGF protein expression in brain tissue of rats in each group after 8 weeks of intervention

2.4 各組大鼠VEGF 與mNESS、rFA 值的相關性分析 干預8 周后，將VEGF 蛋白表達與mNSS 評分、rFA 值進行相關性分析。在EX-1D 組、EX-1W 組中，VEGF 的增加與mNSS 評分的增加呈負相關（r=-0.816，PEX-1D=0.048；r=-0.829，PEX-1W=0.041）。在SED 組、EX-1D 組、EX-1W 組中，VEGF 的增加與rFA 值的增加呈正相關（r=0.872，PSED=0.024；r=0.831，PEX-1D=0.04；r=0.857，PEX-1W=0.029）。在EX-1W組中，rFA 值與mNSS 評分呈負相關（r=-0.854，P=0.03）（圖5）。

圖5 各組大鼠VEGF 與mNESS、rFA 值的相關性分析Fig 5 Correlation analysis of VEGF with mNESS and rFAin rats of each group

3 討論

越來越多的證據支持卒中后的體育鍛煉可以通過誘導神經可塑性來改善神經功能。美國心臟協會已經將有氧運動作為卒中康復中的基本組成部分[12]。由于醫療系統的巨大負擔，大量研究重點關注卒中后的運動康復方案策略，通過減少卒中后認知和運動損傷促進患者恢復[13]。但對卒中后運動開始時間仍然有待深入研究，且多項相互矛盾的結果更突出了卒中后運動開始時間的重要性[3,12]。本研究通過對大鼠卒中后1 d、1 周開始運動組研究發現：與SED 組比較，造模后1 周時EX-1D 組mNSS 評分明顯降低，rFA 明顯升高（P=0.049），而EX-1W 組mNSS 和rFA 值無統計學差異。各組分別8 周干預后，EX-1D 組比EX-1W 組大鼠的mNSS 評分明顯降低（P=0.049），rFA 值明顯增高（P=0.005），EX-1D組的VEGF 表達略高于EX-1W 組，但尚未出現統計學差異（P=0.060）。VEGF 表達水平與mNSS 評分呈負相關，而與rFA 值呈正相關。這些結果表明，腦梗死后的運動干預對大鼠腦組織神經功能的恢復效果優于SED 干預，且EX-1D 組的干預效果更佳。這可能是由于運動促進了卒中后腦組織的VEGF 表達，改善大鼠的FA 值，促進神經功能的恢復。

FA 值是MRI 的一個參數，其變化可以反映幾種生物學基礎狀態，比如軸突填充密度、軸突直徑、髓鞘、神經突密度和取向分布[14]。研究驗證了FA 值對卒中后運動恢復的影響[15]。一項薈萃分析的結果顯示，多數卒中后運動研究中，FA 值與運動恢復結果顯著相關[14]。Sidaros 等[16]發現，FA 值與神經纖維一致性及髓鞘數量呈正相關，FA 值較低可能是由于神經纖維的損害或者神經纖維一致性降低導致。筆者的研究發現EX-1D 組大鼠在腦卒中后干預8周后的rFA 值明顯高于EX-1W 組，且mNSS 評分出現了相反的結果，表明腦卒中后1 d 開始干預，可以有效保護神經，改善大鼠的神經功能，促進運動恢復。

VEGF 涉及到血管生長的所有階段，包括神經血管的發育, 由缺氧驅動的現有血管中的新毛細血管生成, 動脈生成及相應血壓梯度的吻合小動脈通道的擴張[17-19]。VEGF 在卒中期間可以保護缺血性腦梗塞并促進閉塞的腦動脈再通[20]。此外，VEGF 可以促進多種神經元功能的恢復，包括神經元發生、神經元遷移、神經元生長等[21]。筆者的研究發現8 周干預結束后EX-1D 組大鼠的VEGF 表達水平高于EX-1W 組和SED 組，表明卒中后1 d 開始運動更能上調VEGF 的表達。

通過相關性分析，筆者發現VEGF 與mNSS 評分呈負相關，而與rFA 值呈正相關，表明運動通過促進VEGF 的表達，發揮神經保護作用，促進血管再通和神經發生，從而改善卒中后的病理狀態。此外，EX-1D 組大鼠在干預結束時更高的VEGF 表達水平、rFA 值和更低的mNSS 評分，證明卒中后1 d開始的早期運動干預效果更佳。

本研究揭示了腦卒中后8 周運動干預對受損神經功能的保護和改善作用及其內在分子機制，并發現卒中后1 d 開始運動擁有更佳的治療效果。但本實驗樣本例數較少，且早期不同干預時間點劃分較為粗放，是否卒中后24 h 內或3 d 開始運動干預會有更好的治療效果，今后的研究將進一步論證。

綜上所述，筆者的研究證明，卒中后1 d 和卒中后1 周進行8 周的運動干預，可以通過上調大鼠VEGF 的表達，發揮神經保護和改善作用，促進神經功能的恢復，且卒中后1 d 開始干預的效果更佳。