高效液相色譜－串聯質譜法同時測定精神分裂癥患者血漿中文拉法辛和阿立哌唑濃度

王建欣，羅 丹，楊謙謙，高明龍 ，楊繼章

（1. 河北醫科大學第一醫院藥學部，河北 石家莊 050031； 2. 河北醫科大學第一醫院精神衛生科，河北 石家莊 050031）

精神分裂癥陰性癥狀為精神分裂癥的核心癥狀[1]。抗抑郁藥物文拉法辛聯合第2 代抗精神病藥物阿立哌唑能顯著改善精神分裂癥陰性癥狀，且安全有效。但由于抗精神病藥物治療窗相對狹窄，毒副作用較大，且精神分裂癥患者治療的依從性較差，為確保藥物治療安全有效，臨床應用時應監測患者的血藥濃度，以便及時調整給藥方案。目前，國內外測定文拉法辛和阿立哌唑血藥濃度的方法主要有高效液相色譜－串聯質譜（LCMS／MS）法[2－5]和高效液相色譜(HPLC)法[6－9]。本研究中建立了一種能同時快速、準確測定精神分裂癥患者血漿中文拉法辛和阿立哌唑濃度的LC －MS／MS 法，為臨床監測血藥濃度提供參考。現報道如下。

1 儀器與試藥

4000Q TRAP 型質譜儀（配有ESI 源，美國AB SCIEX公司）；HPLC －30A 型液相色譜系統（配有液相輸液泵、自動進樣器、柱溫箱，日本島津公司）；AnaLyst TF 1.6 軟件（美國AB SCIEX 公司）；D3024 型臺式高速微量離心機（美國賽洛捷克公司）；MX －S 型固定式混勻儀（大龍興創實驗儀器有限公司）。

試藥：鹽酸文拉法辛（成都德斯特生物技術有限公司，批號為DST190111 －025，含量不低于98%）；阿立哌唑（上海遠慕生物科技有限公司，批號為J0215AS，含量不低于98%）；鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（惠氏制藥有限公司，批號為X44212C，規格為每粒75 mg）；阿立哌唑片（上海中西制藥有限公司，批號為180357，規格為每片10 mg）；咖啡因（內標，中國食品藥品檢定研究院，批號為171215 －2010，含量為99.9%）；甲醇為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純。

2 方法與結果

2.1 受試者選擇

納入標準：年齡18 ～65 歲，性別不限；體質量指數（BMI）18 ～30 kg／m2；符合《國際疾病分類(第10 版)》（ICD －10）精神分裂癥診斷標準；患者及法定代理人自愿參與本研究。

排除標準：腦器質性疾病所致精神障礙，精神活性物質所致精神障礙、心境障礙、神經官能癥、精神發育遲滯診斷；合并器官功能障礙或其他嚴重系統性疾病；妊娠期或哺乳期；有吸毒史；試驗前2 周內使用過其他藥物；3 個月內參加臨床研究；研究者認為不適宜參與本研究。

入組情況：本試驗經河北醫科大學第一醫院醫學倫理委員會批準。選擇20 例精神分裂癥患者，其中男6 例，女14 例；年齡20 ～43 歲，平均（32.15±6.12）歲；體質量55 ～64 kg，平均（59.25 ±2.67）kg；身高165 ～177 cm，平均（170.75 ±3.55）cm。

2.2 治療方案及血液樣本采集

患者口服鹽酸文拉法辛緩釋膠囊（150 mg ／ d）和阿立哌唑片（10 mg ／ d），于20 d 后清晨服藥前0.5 h時，抽取肘靜脈血5 mL，置含肝素鈉的抗凝離心管中，3 000 r／min 離心10 min，分離血漿，保存在－80 ℃冰箱中，待測。

2.3 色譜與質譜條件

2.3.1 色譜條件

色譜柱：Phenomenex Kinetex XB－C18柱（50 mm ×3 mm，2.6 μm）；流動相：甲醇（A）－2%甲酸水溶液（B)(70 ∶30，V／ V），等度洗脫；流速：0.4 mL／min；柱溫：40 ℃；進樣量：5 μL。

2.3.2 質譜條件

離子源：電噴霧離子源，多反應監測模式掃描，正離子檢測模式；離子源噴射電壓：5 500 V；離子源溫度：600℃；氣簾氣（N2）壓力：20psi；霧化氣（N2）壓力：55psi；輔助氣（GS2，N2）壓力：55 psi；碰撞氣（N2）：High；毛細管：入口電壓為10 V，出口電壓為10 V。質譜參數見表1。

表1 文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的質譜參數

2.4 溶液制備

對照品溶液：取文拉法辛對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質量濃度為1 mg／mL 的文拉法辛貯備液。用甲醇稀釋貯備液，配成質量濃度分別為0.1，0.5，1，2，4，6，8 μg ／mL 的文拉法辛標準曲線溶液，質量濃度分別為0.5，2，6 μg ／mL 的文拉法辛質控樣品溶液，置4 ℃保存備用。取阿立哌唑對照品約10 mg，精密稱定，置10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質量濃度為1 mg／mL 的阿立哌唑貯備液。用甲醇稀釋貯備液，配成質量濃度分別為0.2，0.5，1，2，4，6，8 μg／mL 的阿立哌唑標準曲線溶液，質量濃度分別為0.5，3，7 μg ／mL的阿立哌唑質控樣品溶液，置4 ℃保存備用。

內標溶液：取咖啡因對照品約1 mg，精密稱定，置1 mL 容量瓶中，用甲醇溶解并稀釋至刻度，混勻，配成質量濃度為1 mg ／mL 的咖啡因內標貯備液。取內標貯備液適量，用甲醇稀釋，配成質量濃度為1 μg／mL 的咖啡因內標溶液，置4 ℃保存備用。

2.5 血漿樣品處理

取血漿100 μL，加入內標溶液10 μL、甲醇20 μL，渦旋30 s，加入甲醇270 μL，渦旋60 s，室溫下15 000 r／min離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液5 μL，進樣分析。

2.6 方法學考察

專屬性試驗：分別取空白血漿、空白血漿＋對照品標準溶液、患者用藥1 h 后血漿樣品各6 份，按血漿樣品處理項下方法操作，得到相應樣品色譜圖。結果顯示，文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的保留時間分別為0.58，0.67，0.64 min，血漿中內源性成分對文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因的測定無干擾，專屬性強。色譜圖見圖1。

標準曲線繪制和定量下限考察：取空白血漿100 μL，加入內標溶液和不同質量濃度的文拉法辛、阿立哌唑系列標準曲線溶液各10 μL，配成文拉法辛質量濃度分別為10，50，100，200，400，600，800 ng ／ mL，阿立哌唑質量濃度分別為20，50，100，200，400，600，800 ng／mL的系列血漿樣品溶液，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，以待測物與內標的峰面積之比（Y）對待測物的質量濃度（ X）進行線性回歸，權重系數為1 ／ X2。結 果 顯 示，文 拉 法 辛 的 標 準 曲 線 方 程 為 Y ＝4.87 ×103X ＋1.11 ×105（r ＝0.993 2）， 線 性 范 圍 為10 ～800 ng／mL，定量下限為10 ng ／mL；阿立哌唑的標準曲線方程為Y＝9.94×103X ＋1.69×105（r ＝0.992 8），線性范圍為20 ～800 ng／mL，定量下限為20 ng ／mL。

準確度與精密度試驗：取空白血漿100 μL，加入內標溶液和不同質量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質控樣品溶液各10 μL，配成文拉法辛質量濃度分別為50，200，600 ng ／ mL 和阿立哌唑質量濃度分別為50，300，700 ng／mL 的系列血漿質控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，連續制備3 d并測定，分別計算準確度和日內、日間精密度的RSD。結果顯示，日內、日間精密度的RSD 均小于15%，相對誤差為－4.67 ～7.08，符合生物樣品定量分析的相關要求。詳見表2。

圖1 文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因高效液相色譜圖

表2 血漿中文拉法辛和阿立哌唑的精密度和準確度試驗結果（n ＝6）

提取回收試驗：取不同質量濃度（文拉法辛質量濃度分別為50，200，600 ng／mL，阿立哌唑質量濃度分別為50，300，700 ng／mL）的血漿質控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得相應 峰面積（A）；同時，另取18 份100 μL 空白血漿，分成3 批，分別加入甲醇270 μL，渦旋60 s，室溫下15 000 r／min 離心10 min，取上清液，過0.22 μm 微孔濾膜，取續濾液加入相應濃度的文拉法辛、阿立哌唑和咖啡因溶液適量，渦旋60 s，進樣分析，得相應峰面積（B）。以A／ B 比值計算提取回收率。結果文拉法辛提取回 收 率 分 別 為（93.24 ±4.21）% ，（90.24 ±5.28）% ，（105.34 ±4.56）% ， RSD 分 別 為 4.52% ， 5.85% ，4.33%（n ＝6）；阿立哌唑提取回收率分別為（94.35 ±3.17）% ，（110.24 ±6.74）% ，（94.28 ±3.21）% ， RSD分別為3.36%，6.11%，3.40%（n ＝6）；內標提取回收率為（93.67 ±2.44）%，RSD 為2.60%（n ＝6），符合生物樣品定量分析的相關要求[10]。

基質效應考察：取空白血漿100 μL，按“血漿樣品處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得空白基質后，加入內標溶液和不同質量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質控樣品溶液各10 μL，配成文拉法辛質量濃度分別為50，200，600 ng／mL 和阿立哌唑質量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 的基質考察樣品溶液各6 份，進樣分析，得相應峰面積（C）；用純水代替血漿，加入內標溶液和不同質量濃度的文拉法辛、阿立哌唑質控樣品溶液適量，配成文拉法辛質量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 和阿立哌唑質量濃度分別為50，300，700 ng ／mL 的質控樣品溶液各6 份，按“血漿樣品的處理”項下自“渦旋30 s”后同法操作，得相應峰面積（D）。內標歸一化的基質因子＝C／ D ×100%。結果文拉法辛在3 個質量濃度下的平均內標歸一化的基質因子分別為91.24% ，104.82%，107.32%（RSD ＜15%，n ＝6），阿立哌唑在3 個質量濃度下的平均內標歸一化的基質因子分別為92.74%，102.51%，96.45%（RSD ＜15%，n ＝6），咖啡因的平均內標歸一化的基質因子為104.81%（RSD ＜15%，n ＝6），提示樣品測定不受基質效應影響。詳見表3。

表3 基質效應試驗結果（n ＝6）

穩定性考察：取不同質量濃度（文拉法辛質量濃度分別為50，200，600 ng／mL 和阿立哌唑質量濃度分別為50，300，700 ng／mL）的血漿質控樣品溶液各24 份，分成4 批，分別考察在室溫放置8 h、處理后室溫放置3 d、反復凍融3 次、－40 ℃凍存1 周的穩定性。結果血漿質控樣品在上述條件下均穩定，RSD 均小于15%(n ＝6)。詳見表4。

2.7 臨床應用

20 例精神分裂癥患者文拉法辛的穩態血藥濃度為140.62 ～483.54 ng／mL，阿立哌唑的穩態血藥濃度為140.83 ～527.65 ng／mL。詳見表5。

表4 穩定性試驗結果（± s，n ＝6）

表4 穩定性試驗結果（± s，n ＝6）

待測物文拉法辛阿立哌唑質量濃度（ng ／mL）50 200 600 50 300 700室溫放置8 h 處理后室溫放置3 d 反復凍融3 次 －40 ℃凍存1 周質量濃度（ng ／mL）48.24 ±5.27 204.51 ±23.24 612.14 ±65.40 49.17 ±5.46 291.54 ±32.14 714.59 ±74.28 RSD（%）10.92 11.36 10.68 11.10 11.02 10.39質量濃度（ng／mL）51.24 ±5.78 201.27 ±21.08 587.34 ±62.42 48.75 ±5.27 294.34 ±28.75 704.71 ±68.54 RSD（%）11.28 10.47 10.63 10.81 9.77 9.73質量濃度（ng ／mL）52.41 ±6.16 212.34 ±19.44 614.27 ±58.94 48.54 ±4.86 310.21 ±31.42 706.27 ±70.27 RSD（%）11.75 9.16 9.60 10.01 10.13 9.95質量濃度（ng ／mL）48.67 ±5.48 194.66 ±18.54 607.24 ±60.27 51.24 ±5.10 308.54 ±30.96 692.47 ±68.21 RSD（%）11.26 9.52 9.93 9.95 10.03 9.85

表5 20 例精神分裂癥患者服藥后血漿中文拉法辛和阿立哌唑的血藥濃度監測結果

3 討論

本研究中建立了能同時測定血漿中文拉法辛和阿立哌唑質量濃度的LC －MS／MS 法，與傳統的HPLC 法及單一樣品檢測方法[6－7，10－11]相比，靈敏度及專屬性均有提高，且縮短了分析時間。采用甲醇沉淀蛋白法處理血漿樣品，與液－液萃取法[6－7，10]、固相萃取法[8]及乙腈沉淀蛋白[2，5]相比，提取回收率較高，操作簡便、快速，有利于節約成本。

20 例精神分裂癥患者給予臨床常規劑量文拉法辛和阿立哌唑，達穩態時，測得文拉法辛的血藥濃度為140.62 ～483.54 ng ／mL，1 例患者高于其有效血藥濃度100 ～400 ng／mL 范圍[12]；測得阿立哌唑的血藥濃度為140.83 ～527.65 ng ／mL，1 例患者低于其有效血藥濃度150 ～500 ng／mL 范圍[13－14]，2 例患者高于該濃度范圍。可見，這2 種藥物在不同人群中存在一定的個體差異。文拉法辛聯合阿立哌唑治療精神分裂癥，應監測治療藥物血藥濃度，及時調整給藥劑量，做到個體化用藥，才能保證用藥安全有效。