響應面法優化杠板歸總黃酮微波提取工藝

黃道明，黃 平，沈麗霞

（1. 江西省上饒市食品藥品檢驗檢測中心，江西 上饒 334000； 2. 江西醫學高等專科學校，江西 上饒 334000；3. 中國人民解放軍第971 醫院，山東 青島 266072）

杠板歸又稱貫葉蓼、犁頭藤等，是蓼科植物杠板歸Polygonum perfoliatum L. 的干燥地上部分，夏季開花時采收，曬干而成，在全國各地均有分布。杠板歸具有清熱解毒、利水消腫、止咳的功效，主治咽喉腫痛、肺熱咳嗽、小兒頓咳、水腫尿少、濕熱瀉痢、濕疹、癤腫、蛇蟲咬傷等[1－2]。黃酮類化合物是杠板歸的有效成分之一，具有抗腫瘤、抗氧化、抗心律失常等作用[3－5]。目前，杠板歸中總黃酮的提取工藝主要通過正交試驗優化，尚未見通過響應面法優化的研究報道。響應面法是應用合理的試驗設計，采用多元二次回歸方程來擬合因素與響應值之間的函數關系，可通過回歸方程的分析來尋求最優工藝參數，解決多變量問題的一種統計方法[6－7]。本研究中采用響應面法對微波提取杠板歸總黃酮的工藝參數進行了優化，旨在為杠板歸藥材的進一步開發和利用奠定理論基礎。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

UV － 2100 型分光光度計（上海尤尼柯儀器有限公司）；CW － 2008 型微波提取儀器（上海松野儀器有限公司）；SB － 2000 型旋轉蒸發器（上海亞龍儀器有限公司）；101AB － 2 型真空泵（上海神光儀器有限公司）。

1.2 試藥

杠板歸干燥藥材，購自江西新東港中藥飲片有限公司，經江西上饒市食品藥品檢驗所中藥室付彩群中藥師鑒定為正品，干燥，粉碎，過60 目篩，備用；蘆丁對照品（純度為98.9%，中國食品藥品檢定研究院）；其余試劑均為分析純；試驗用水均為去離子水。

2 方法與結果

2.1 杠板歸總黃酮提取工藝流程

取干燥后的杠板歸粉末樣品10 g，精密稱定，在100 mL 圓底燒瓶中加入一定體積分數的乙醇，在擬訂試驗條件下（提取時間、提取功率、液料比和乙醇濃度等），采用間歇微波輔助提取法（30 s，放置1 min）提取杠板歸中總黃酮。樣品在一定微波功率下提取設定的時間后，經過濾分離，低速離心10 min，取上清液，置旋轉蒸發儀50 ℃減壓濃縮，再定容于10 mL 容量瓶，經

0.45 μm 微孔濾膜濾過，備用。精密吸取各供試品溶液10μL，按上述擬訂條件測定峰面積，以回歸方程計算含量。

2.2 標準曲線的制作與黃酮得率計算

取經干燥至恒重的蘆丁對照品10.0 mg，精密稱定，置50 mL 容量瓶中，加入乙醇溶液定容，即得蘆丁對照品溶液。分別精密吸取1，2，3，4，5，6，7 mL，置25 mL容量瓶中，各加1 mL 5%亞硝酸鈉溶液，搖勻，靜置6 min后分別加入1 mL 10%硝酸鋁溶液，搖勻，靜置6 min 后分別加入10 mL 4%氫氧化鈉溶液，搖勻，最后用65%乙醇定容至刻度，搖勻，放置15 min；以空白試劑為參比液，在500 nm 波長處測定吸光度。以蘆丁對照品溶液質量濃度（X，mg／mL）為橫坐標、吸光度（Y）為縱坐標制作標準曲線，得回歸方程Y＝7.9561X＋0.0068，r ＝0.9995(n ＝7)。根據回歸方程計算總黃酮濃度，并計算總黃酮得率。

2.3 響應面法優化試驗設計

單因素考察：通過單因素法，對不同提取時間（10，15，20，25，30 min），不同乙醇體積分數（40% ，50% ，60% ，70%，80%），不同提取溫度（40，50，60，70，80 ℃），不同液料比（40 ∶1，45 ∶1，50 ∶1，55 ∶1，60 ∶1）進行考察。結果見圖1。

圖1 不同提取時間、溫度、乙醇體積分數和液料比對杠板歸總黃酮得率的影響

試驗設計與結果：根據單因素試驗結果，采用星點設計法，以提取溫度（A）、提取時間（B）、乙醇體積分數（C）和液料比（D）4 個因素為自變量，每個因素取3 個水平，以杠板歸總黃酮得率為響應值進行試驗分析。因素水平見表1，結果見表2。

表1 響應面優化試驗因素水平表

數據分析：采用統計軟件Design－Expert 對表2 中的數據進行多元回歸擬合，得總黃酮得率對編碼自變量A，B，C，D 的回歸方程：Y ＝5.65 ＋0.31 A－8.333 E －003 B － 0.048 C ＋0.060 D － 0.013 AB ＋0.065 AC －0.045 AD －0.042 BC －0.030 BD ＋0.03 CD－0.52 A2－0.30B2－0.25C2－0.32 D2。該模型回歸顯著（P ＜0.000 1），模型的復相關系數（r）＝0.998 2，表明該回歸方程回歸效果較好，試驗誤差較小。模型的校正決定系數（R2adj）＝0.995 3，表明該模型可信度較高。失擬項P ＞0.05，表明該模型失擬不顯著，說明該回歸方程能較好地擬合真實的效應面，證實應用星點設計－效應面法優化杠板歸總黃酮提取率可行。

表2 響應面分析試驗設計方案與結果

響應面分析：通過多元回歸方程作響應面圖（見圖2 至圖7），可較直觀地反映各因素間的交互作用。

最佳提取條件確定：通過軟件Design－Expert 分析得出杠板歸總黃酮最佳提取工藝為提取溫度62.91 ℃，提取時間18.96 min，乙醇體積分數59.49%和液料比50.36。考慮到實際操作因素，將測定條件修正為提取溫度60 ℃，提取時間20 min，乙醇體積分數60%和液料比50 ∶1。

驗證試驗：為檢驗效應面法所得結果的可靠性，采用上述修正條件進行杠板歸總黃酮的微波提取試驗，得到杠板歸總黃酮平均得率為5.69%（n ＝3），與理論預測值5.67%非常接近。因此，利用響應面分析法優化杠板歸總黃酮的提取工藝參數真實、可靠，具有實用價值。

3 討論

3.1 提取方法選擇

杠板歸的主要有效成分為黃酮類化合物，傳統回流提取法存在溶劑消耗量大、提取效率低、提取時間長及污染環境等缺點，本研究中選擇微波提取法提取杠板歸總黃酮，并對提取工藝進行改進優化，以更大程度地利用該藥材[8]。

圖2 提取溫度與提取時間對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

圖3 提取溫度與乙醇體積分數對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

圖4 提取溫度與液料比對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

圖5 乙醇體積分數與提取時間對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

圖6 提取時間與液料比對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

圖7 乙醇體積分數與液料比對提取物中總黃酮得率的響應曲面及等高線圖

3.2 考察因素選擇

通過正交試驗法對不同提取工藝進行比較，結果表明，提取時間、乙醇體積分數、液料比、提取溫度等因素對杠板歸總黃酮的提取均有影響，且乙醇體積分數和提取時間影響最顯著。故本研究中選擇提取時間、乙醇體積分數、液料比、提取溫度4 個因素為考察因素[9]。

3.3 優化方法選擇

當前，藥材有效成分的提取工藝研究多為正交試驗，其結果直觀易分析，但得到的優選值只是試驗所用水平的某一種組合，具有局限性。與其相比，響應面法能更好地解釋多因素與響應值之間的關系，特別是因素之間存在的交互作用。響應面法是將一系列的試驗數據用多項式進行擬合，得出回歸方程，然后將函數以圖形的方式表現出來，更能直觀地分析出各個因素與響應面之間的關系及因素之間的交互關系。故本試驗中選擇響應面法優化杠板歸總黃酮的提取工藝[10－11]。

3.4 方法評價

在單因素試驗基礎上，本研究中首次采用星點設計－效應面試驗設計法，對微波提取杠板歸總黃酮的工藝進行了優化，并建立了回歸模型。此模型極顯著，模型的r ＝0.998 2，R2adj＝0.995 3，失擬項不顯著，可用于杠板歸總黃酮提取工藝分析和預測。優化后確定的杠板歸總黃酮最佳提取工藝條件為提取溫度60 ℃，提取時間20 min，乙醇體積分數60%和液料比50 ∶1。該方法工藝簡單，提取率較高，且省時、節能、提取效率高，可為杠板歸資源的綜合利用奠定基礎。