決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑質(zhì)量評價(jià)研究

陳 萍，郭 冬，楊 錦，薛佩蕓

（1. 陜西中醫(yī)藥大學(xué)，陜西 咸陽 712046； 2. 陜西省中醫(yī)藥研究院，陜西 西安 710003）

決明子為豆科決明屬植物決明Cassia obtusifolia L.或小決明Cassia tora L. 的干燥成熟種子，味甘、苦、咸，微寒，歸肝經(jīng)、大腸經(jīng)，具有清熱明目、潤腸通便的功效[1]。現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明，決明子具有調(diào)脂、降血壓、保肝、明目、抗氧化、抗菌、抗腫瘤等功效，是藥食同源物質(zhì)[2－4]。其主要化學(xué)成分包括蒽醌類（橙黃決明素、蘆薈大黃素、黃決明素、大黃素、大黃酚、大黃素甲醚等），萘并吡喃酮類（紅鐮霉素龍膽二糖苷、決明子苷C、橙黃決明素－6－ O－β－D－葡萄糖苷等），脂肪酸類及多糖類等[3－5]。中藥標(biāo)準(zhǔn)湯劑作為一種標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)和標(biāo)準(zhǔn)體系，其質(zhì)量評價(jià)研究可為衡量配方顆粒質(zhì)量均一性、評價(jià)配方顆粒與臨床湯劑一致性提供參考[6－11]。本研究中通過制備決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑，并建立特征指紋圖譜和多指標(biāo)成分分析方法評價(jià)其質(zhì)量。現(xiàn)報(bào)道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1260 型高效液相色譜儀，二極管陣列（DAD）檢測器（美國Agilent 公司）；KQ－500DE 型數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司，功率為250 W，頻率為50 Hz）；BT25S 型電子天平（賽多利斯科學(xué)儀器有限公司，精度為十萬分之一）；CP2102 型電子天平（奧豪斯儀器有限公司，精度為十萬分之一）。

1.2 試藥

橙黃決明素對照品（批號為111900 －201605，含量為98.3% ），蘆薈大黃素對照品（批號為110795 －201710，含量為98.3%），黃決明素對照品（批號為E －2333，含量為98.2%），大黃素對照品（批號為110756 －201512，含量為98.7% ），大黃酚對照品（批號為110796 －201621，含量為99.2%），大黃素甲醚對照品（批號為110758 －201616，含量為99.0%），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈，磷酸均為色譜純，水為超純水，其余試劑均為分析純；21批決明子飲片（編號S1－S21，批號見表1）分別產(chǎn)自安徽、河南、廣西、云南等地，經(jīng)陜西省中醫(yī)藥研究院楊智峰教授鑒定為正品。

表1 市售21 批決明子質(zhì)量考察結(jié)果

2 方法與結(jié)果

2.1 市售決明子飲片質(zhì)量考察

根據(jù)2015 年版《中國藥典（一部）》決明子飲片項(xiàng)下規(guī)定，對市售21 批決明子飲片進(jìn)行質(zhì)量考察，結(jié)果見表1。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備

根據(jù)國家中醫(yī)藥管理局頒布的《醫(yī)療機(jī)構(gòu)中藥煎藥室管理規(guī)范》原則[12]，按表1 依次稱取15 批合格決明子飲片各150 g，分別加入8 倍量純凈水，浸泡30 min，沸騰后加熱回流30 min，趁熱過濾，藥渣再加8 倍水，加熱回流30 min，趁熱過濾，合并濾液，以水定容至2 500 mL，即得1 ～15 號樣品，備用。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)湯劑中橙黃決明素及大黃酚含量測定[13 －14]

2.3.1 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱：Welchrom C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：乙腈（A）－0.1% 磷酸水溶液（B），梯度洗脫，0 ～15 min 時(shí)38%A，15 ～30 min 時(shí)38%A －90%A，30 ～40 min 時(shí)90%A，40 ～45 min 時(shí)38%A；流 速：1.0 mL ／ min；檢測波長：284 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：10 μL。分別取對照品溶液及供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，橙黃決明素和大黃酚的保留時(shí)間分別為18.436 min 和31.877 min，各成分色譜峰與相鄰峰分離度均大于1.5，理論板數(shù)均大于7 800，拖尾因子0.95 ～1.05。色譜圖見圖1。

圖1 高效液相色譜圖

2.3.2 溶液制備

取橙黃決明素對照品、大黃酚對照品適量，精密稱定，加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液制成含橙黃決明素131.65 μg ／mL、大黃酚246.8 μg／mL 的混合對照品母液。精密吸取母液1.5 mL，置10 mL 容量瓶中，以無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液稀釋至刻度，即得對照品溶液。分別精密吸取1 ～15 號標(biāo)準(zhǔn)湯劑各20 mL，加鹽酸1.0 mL，置水浴中加熱水解1 h，立即冷卻，用三氯甲烷振搖提取4 次，每次30 mL，合并三氯甲烷液，回收溶劑至干，殘?jiān)脽o水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液溶解，轉(zhuǎn)移至25 mL 容量瓶中，并稀釋至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得供試品溶液。

2.3.3 方法學(xué)考察

線性關(guān)系考察：分別精密量取對照品母液0.1，0.5，1.0，1.5，2.0，2.5 mL，分別加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液定容于10 mL 容量瓶。分別吸取10 μL 注入高效液相色譜儀，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，重復(fù)2 次。以各成分的峰面積平均值（Y）為縱坐標(biāo)、對應(yīng)成分的質(zhì)量濃度（X，μg／mL）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果見表2。

精密度試驗(yàn)：分別取2.3.2 項(xiàng)下對照品溶液及供試品溶液（1 號），按擬訂色譜條件分別連續(xù)進(jìn)樣6 次。結(jié)果對照品溶液中橙黃決明素及大黃酚峰面積的RSD 分別為0.09%和0.12%（n ＝6），供試品溶液中橙黃決明素及大黃酚峰面積的 RSD 分別為0.35% 和0.24%（n ＝6），表明儀器精密度良好。

表2 橙黃決明素及大黃酚線性關(guān)系考察結(jié)果( n ＝6)

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.3.2 項(xiàng)下供試品溶液（1 號），分別于0，2，4，8，12，20，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果橙黃決明素及大黃酚峰面積的RSD 分別為0.88%和0.96%（n ＝7），表明供試品溶液24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑（1 號），依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。結(jié)果橙黃決明素及大黃酚峰面積的 RSD 分別為2.86% 和2.72%（n ＝6），表明方法重復(fù)性良好。

加樣回收試驗(yàn)：精密量取已知含量的決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑（1 號）6 份，各2.0 mL，分別加入橙黃決明素及大黃酚對照品貯備液適量，依法制備供試品溶液，定容至5 mL，按擬訂色譜條件測定，計(jì)算回收率。結(jié)果見表3。

2.3.4 樣品含量測定

分別精密吸取2.3.2 項(xiàng)下1 ～15 號供試品溶液各10 μL，按擬訂色譜條件測定，計(jì)算供試品溶液中橙黃決明素和大黃酚的含量。結(jié)果見表4。

2.4 決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率及轉(zhuǎn)移率測定

出膏率：精密量取1 ～15 號決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑各100mL，置已恒重的蒸發(fā)皿中，水浴蒸干，于烘箱105 ℃干燥至恒 重，計(jì) 算 出 膏 率。 y（% ）＝[（m1／100 × V）／ m2] ×100%（y 為出膏率，m1為干浸膏質(zhì)量，V 為樣品溶液總體積，m2為飲片質(zhì)量）。結(jié)果見表4。15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率為9.57% ～14.39%，平均（12.32 ±1.35）%。

轉(zhuǎn)移率：計(jì)算橙黃決明素及大黃酚轉(zhuǎn)移率。指標(biāo)成

表4 標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率、指標(biāo)成分含量及轉(zhuǎn)移率測定結(jié)果（%）

分的轉(zhuǎn)移率（%）＝(標(biāo)準(zhǔn)湯劑中指標(biāo)成分的含量／飲片中指標(biāo)成分的含量) ×100%。結(jié)果見表4。15 批標(biāo)準(zhǔn)湯劑橙黃決明素轉(zhuǎn)移率為82.93% ～89.53% ，平均（84.92±2.57）%；大黃酚轉(zhuǎn)移率為22.33% ～25.68%，平均（23.82 ±0.97）%。

2.5 HPLC －DVD 特征指紋圖譜

2.5.1 色譜條件

同2.3.1 項(xiàng)下色譜條件。

2.5.2 溶液制備

分別稱取橙黃決明素對照品、蘆薈大黃素對照品、黃決明素對照品、大黃素對照品、大黃酚對照品及大黃素甲醚對照品，精密稱定，加無水乙醇－乙酸乙酯（2 ∶1，V／ V）混合溶液，制成含橙黃決明素263.3 μg／mL、蘆薈大黃素252.0 μg／mL、黃決明素247.8 μg／mL、大黃素247.6 μg／mL、大黃酚246.8 μg／mL、大黃素甲醚201.8 μg／mL 的混合對照品溶液，即得對照品溶液。按

表3 加樣回收試驗(yàn)結(jié)果（n ＝9）

2.3.2 項(xiàng)下方法制備1 ～15 號供試品溶液。

2.5.3 方法學(xué)考察

精密度試驗(yàn)：取2.5.2 項(xiàng)下供試品溶液（1 號），按擬訂色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6 次，色譜圖見圖2。可見，1 號色譜峰（橙黃決明素）在決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備過程中相對較穩(wěn)定、含量高、分離度好，故被選作參照峰。色譜圖中10 個(gè)共有峰的相對保留時(shí)間（RRT）和相對峰面積（RPa）的RSD 小于3% ( n ＝6)，表明儀器精密度良好。詳見表5。

穩(wěn)定性試驗(yàn)：取2.5.2 項(xiàng)下供試品溶液（1 號），于0，2，4，8，12，24 h 時(shí)按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定，色譜圖中10 個(gè)共有峰RRT 和RPa 的RSD 見表5，表明供試品溶液在24 h 內(nèi)穩(wěn)定。

重復(fù)性試驗(yàn)：取同一標(biāo)準(zhǔn)湯劑（1 號），依法平行制備6 份供試品溶液，按擬訂色譜條件進(jìn)樣測定。色譜圖中10 個(gè)共有峰RRT 和RPa 的RSD 見表5，表明方法重復(fù)性良好。

2.5.4 指紋圖譜測定及特征峰指認(rèn)

按擬訂色譜條件對15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品的特征圖譜進(jìn)行測定，以對照品的保留時(shí)間和紫外光譜進(jìn)行特征峰確認(rèn)，其中決明子的典型色譜圖見圖2。

2.5.5 相似度評價(jià)

將15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑圖譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入國家藥典委員會的《中藥色譜指紋圖譜相似度評價(jià)系統(tǒng)（2004A版）》。參照圖譜設(shè)為S0，對照圖譜生成方法設(shè)為平均數(shù)，時(shí)間窗寬度設(shè)為0.10，多點(diǎn)校正，自動(dòng)匹配，生成對照，計(jì)算相似度。結(jié)果見表6。15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)煎液的指紋圖譜見圖3。結(jié)果15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑與對照指紋圖譜相似度均大于0.9，表明一致性好。

表5 決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性試驗(yàn)測定結(jié)果（%，n ＝6）

圖2 決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征指紋圖譜

3 討論

3.1 質(zhì)量評價(jià)

本研究中主要從飲片質(zhì)量控制、標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程、標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量控制3 個(gè)方面進(jìn)行質(zhì)量評價(jià)，其中標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備過程嚴(yán)格遵守其標(biāo)準(zhǔn)化操作[12]，所得15 批湯劑平均出膏率為（12.32 ±1.35）%，橙黃決明素平均轉(zhuǎn)移率為（84.92 ±2.57）%，大黃酚平均轉(zhuǎn)移率為（23.82 ±0.97）%。通過建立標(biāo)準(zhǔn)湯劑的橙黃決明素和大黃酚含量測定方法，同時(shí)建立標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征指紋圖譜測定方法，從指紋準(zhǔn)確定性和指標(biāo)成分定量方面達(dá)到了對決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑整體質(zhì)量的評價(jià)。

表6 15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑指紋圖譜相似度評價(jià)結(jié)果

圖3 15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑的特征指紋圖譜

3.2 參數(shù)范圍確定

以本研究中所建立的15 批決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑各參數(shù)均值的75% ～125%計(jì)，出膏率為9.24% ～15.4%，橙黃決明素轉(zhuǎn)移率為63.69% ～106.15%，大黃酚轉(zhuǎn)移率為17.86% ～29.78。各項(xiàng)實(shí)測值均在標(biāo)準(zhǔn)湯劑參數(shù)范圍內(nèi)，表明決明子標(biāo)準(zhǔn)煎液質(zhì)量均一性好。

3.3 指標(biāo)成分篩選與評價(jià)

出膏率和煎煮時(shí)間緊密相關(guān)，煎煮90 min 后出膏率含量最高，并趨于穩(wěn)定。本試驗(yàn)按標(biāo)準(zhǔn)化操作[12]，因此出膏率偏低。按2015 年版《中國藥典（一部）》決明子飲片測定橙黃決明素及大黃酚含量的方法，標(biāo)準(zhǔn)湯劑中橙黃決明素提取率高、轉(zhuǎn)移率穩(wěn)定，能表征提取物的均一性；大黃酚含量較低，可能是由其熱不穩(wěn)定性和（或）煎煮過程中轉(zhuǎn)化為其他黃酮類成分造成，具體原因有待進(jìn)一步研究，故選用橙黃決明素為質(zhì)量評價(jià)的指標(biāo)成分。

3.4 指紋圖譜分析

開展特征指紋圖譜研究時(shí)，考慮到應(yīng)最大限度地檢出化學(xué)成分，試驗(yàn)選用乙腈－0.1%磷酸水溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，0 ～35 min 時(shí)18%→19%乙腈，35 ～55 min 時(shí)19%→36%乙腈，55 ～80 min 時(shí)36%→85%乙腈，80 ～85 min 時(shí)85% 乙腈，85 ～86 min 時(shí)85% →18%乙腈[15－16]，各化學(xué)成分出峰滯后（55 min 后）。經(jīng)反復(fù)試驗(yàn)，最終選擇本試驗(yàn)中的洗脫條件，出峰數(shù)量多、保留時(shí)間合適。決明子標(biāo)準(zhǔn)湯劑檢出10 個(gè)特征指紋共有峰，其中4，5，7，8 號共有峰的相對峰面積較大，目前未能指認(rèn)出，還有待后期進(jìn)一步研究。