益腎化濕顆粒質量標準提高研究

盧秋梅，黎 倩，黃艷霞，栗建明

（1. 廣州市藥品檢驗所·國家藥品監督管理局中成藥質量評價重點實驗室，廣東 廣州 510160；2. 廣州康臣藥業有限公司，廣東 廣州 510635）

益腎化濕顆粒為廣州康臣藥業有限公司獨家品種，處方源自《脾胃論》中的升陽益胃湯，由人參、黃芪、黃連等16 味中藥組方[1]，功效為升陽補脾、益腎化濕、利水消腫，用于脾虛濕盛證所致蛋白尿，兼見水腫、疲倦乏力、畏寒肢冷、納少等證[2]。該方傳統劑型為湯劑，不易貯存及攜帶，顆粒劑克服了湯劑的不足，具有穩定、易攜帶的特點[3]。目前，該藥僅有局頒標準(國家食品藥品監督管理局標準YBZ04482009)。在此基礎上，本研究中新增了人參的薄層色譜（TLC）鑒別和黃芪中黃芪甲苷的高效液相色譜（HPLC）法含量測定，修訂了人參的HPLC 含量測定方法（增加人參皂苷Rg1和Re 指標），完善了黃芪、獨活、甘草、白芍、黃連和陳皮的TLC 鑒別方法。現報道如下。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

P300H 型超聲波清洗器（德國Elma 公司，功率為300 W，頻率為37 kHz）；TLC 板加熱器，TLC Visualizer薄層成像系統(瑞士Camag 公司)；XP26 型電子天平(精度為0.1 mg)；MS204S 型電子天平(精度為0.001 mg），均購自瑞士Mettler Toledo 公司；ST16 型高速離心機（美國賽默飛公司）；TW12 型恒溫水浴鍋(德國Julabo 公司)；硅膠G60 薄層板（德國Merck 公司）；1260Ⅱ型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司)，包括Alltech 6000 蒸發光散射檢測器，Openlab CDS 2.2 色譜工作站。

1.2 試藥

益腎化濕顆粒（批號分別為20180608，20180609，20180701，規格為每袋10 g）及所有陰性樣品均購自廣州康臣藥業有限公司；對照藥材黃芪（批號為120974 －201612）、人參（批號為120917 －201712）、獨活（批號為120940 －201612）、甘草（批號為120904 －201620）、白芍（批號為120905 －201610）、黃連（批號為120913 －201611）、陳皮（批號為120969 －201510），以及對照品人參皂苷Rg1（批號為110703 －201832）、人參皂苷Re（批號為110754 －201827）、人參皂苷Rb1（批號分別為110704 －201726，110704 －201827）、黃芪甲苷（批號為110781 －201717）、芍藥苷（批號為110736 －201842）、鹽酸小檗堿（批號為110713 －201814）、橙皮苷（批號為110721 －201818）、二氫歐山芹醇當歸酸酯（批號為111583 －201304），均購自中國食品藥品檢定研究院；乙腈為色譜純，其他試劑均為分析純，水為純化水。

2 方法與結果

2.1 TLC 鑒別

人參、黃芪：取本品4 g，加水40 mL 溶解，離心，取上清液，用乙醚萃取3 次，每次30 mL，合并乙醚液（備用），分取水溶液（溶液1）10 mL，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次10 mL，合并正丁醇液，用氨試液提取3 次，每次30 mL，棄去氨試液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇2 mL 使溶解，作為供試品溶液。取人參對照藥材0.5 g，黃芪對照藥材1 g，同法制成對照藥材溶液。分別取缺人參、黃芪的陰性樣品適量，同法制得缺人參、黃芪陰性對照品溶液。取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re、人參皂苷Rb1及黃芪甲苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含1 mg 的混合溶液，作為對照品溶液。吸取上述溶液1 ～2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯－稀氨液（5→50，4 ∶1 ∶5，V／ V／ V）的上層溶液為展開劑，另槽加入10 mL 濃氨試液，預平衡15 min，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，置日光及紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖1。可見，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上分別顯相同顏色的斑點或熒光斑點，陰性對照無干擾。

圖1 人參、黃芪薄層色譜圖

圖2 甘草、黃連、陳皮薄層色譜圖

甘草：取水溶液1，用水飽和正丁醇振搖提取3 次，每次20 mL，合并正丁醇液，正丁醇蒸干，殘渣加甲醇2 mL使溶解，作為供試品溶液。取甘草對照藥材0.5 g，加水40 mL，煎煮30 min，濾過，取濾液同法制成對照藥材溶液。取缺甘草陰性樣品適量，同法制得缺甘草陰性對照品溶液。吸取上述3 種溶液各5 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上使成條帶狀，以乙酸乙酯－冰醋酸－甲酸－水（15 ∶1 ∶1 ∶2，V／ V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇，105 ℃加熱至斑點顯色清晰，日光下檢視。色譜圖見圖2 A。可見，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液色譜相應位置上顯相同顏色的斑點，陰性對照無干擾。

黃連：取本品4 g，加95%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，濾液濃縮至5 mL，作為供試品溶液（溶液2）。取黃連對照藥材0.2 g，同法制成對照藥材溶液。取缺黃連陰性樣品適量，同法制得缺黃連陰性對照品溶液。取鹽酸小檗堿對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.5 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取供試品溶液、對照藥材溶液及陰性樣品溶液各4 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上使呈條帶狀，以甲苯－乙酸乙酯－甲醇－異丙醇－水（6 ∶3 ∶2 ∶1.5 ∶0.3，V／ V／ V／ V／ V）為展開劑，另槽加入10 mL 濃氨試液，預平衡15 min，展開，取出，晾干，置紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖2 B。可見，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

陳皮：取陳皮對照藥材0.3 g，加95%乙醇15 mL，超聲30 min，過濾，濾液蒸干，定容至5 mL，作為對照藥材溶液。取缺陳皮陰性樣品適量，同法制得缺陳皮陰性對照品溶液。取橙皮苷對照品，加甲醇制成每1 mL 含0.4 mg 的溶液，作為對照品溶液。吸取溶液2、對照藥材溶液及缺陳皮陰性對照品溶液各4 μL、對照品溶液2 μL，分別點于同一硅膠G 薄層板上（條狀點樣），以三氯甲烷－甲醇－水（28 ∶10 ∶1，V／ V／ V）為展開劑，展開，取出，晾干。噴以5%三氯化鋁乙醇溶液，在105 ℃加熱數分鐘，置紫外光（365 nm）下檢視。色譜圖見圖2 C。可見，供試品溶液色譜中，在與對照藥材溶液和對照品溶液色譜相應位置上顯相同顏色的熒光斑點，陰性對照無干擾。

2.2 含量測定

2.2.1 色譜條件與系統適用性試驗

色譜柱：Waters X select HSS T3 十八烷基硅烷鍵合硅膠柱（250 mm ×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈（A）－水（B），梯度洗脫程序見表1；蒸發光散射檢測器，漂移管溫度：105 ℃，載氣流速：3.0 L／min。在此色譜條件下，各成分分離度良好，陰性對照無干擾，理論板數按人參皂苷Rg1峰計算應不低于6 000。色譜圖見圖3。

表1 流動相梯度洗脫程序（%）

圖5 含量測定高效液相色譜圖

2.2.2 溶液制備

取各對照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL 含人參皂苷Rg10.08 mg、人參皂苷Re 0.13 mg、人參皂苷Rb10.20 mg 和黃芪甲苷0.07 mg 的混合溶液，即得對照品溶液。取本品約4 g，混勻，研細，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加水50 mL，超聲處理（功率為300 W，頻率為37 kHz）30 min，放冷，再稱定質量，用水補足減失的質量，離心10 min，取上清液25 mL，加乙醚振搖提取3 次，每次30 mL，棄去乙醚液，水液再用水飽和正丁醇提取5 次，每次25 mL，合并正丁醇提取液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40 mL，合并氨試液，用水飽和正丁醇提取2 次，每次20 mL，合并正丁醇液，蒸干，殘渣加甲醇溶解，轉移至5 mL 容量瓶中，加甲醇至刻度，搖勻，即得供試品溶液。分別取缺人參陰性樣品、缺黃芪陰性樣品，按供試品溶液制備方法制備缺人參和缺黃芪陰性對照品溶液。

2.2.3 方法學考察

線性關系考察：配制線性關系考察樣品溶液6 份，進樣10 μL，以質量濃度的對數（X，mg／mL）為橫坐標、峰面積的對數（Y）為縱坐標繪制校正曲線。結果見表2。

表2 各成分線性關系考察結果

重復性試驗：取樣品（批號為180608）6 份，精密稱定，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件測定。結果人參皂苷Rg1，Re，Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為1.75%，3.33%，2.88%，3.07%（n ＝6），表明方法重復性良好。

穩定性試驗：取樣品（批號為180608）4 g，精密稱定，依法制備供試品溶液，分別于0，4，8，12，16，20，24，28 h 時按擬訂色譜條件測定。結果人參皂苷Rg1，Re，Rb1及黃芪甲苷含量的RSD 分別為3.71% ，2.40% ，1.81%，1.73%（n ＝8），表明供試品溶液28 h 內穩定。

加樣回收試驗：取樣品（批號為180608）6 份，每份2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入混合對照品溶液（質量濃度分別為0.414 55，1.007 46，1.504 21，0.538 47 mg／mL 的人參皂苷Rg1，Re，Rb1和黃芪甲苷）1 mL，揮干，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算回收率。結果見表3。

2.2.4 樣品含量測定

為確保含量數據更具有代表性，廣州康臣藥業有限公司增加樣品15 批，共18 批樣品，依法制備供試品溶液，按擬訂色譜條件進樣測定，計算含量。結果見表4。按人參皂苷總量、黃芪甲苷含量平均值的80%設限，結果分別為1.08，0.26 mg ／g。擬規定樣品中每1 g 含人參以人參皂苷Rg1（C42H72O14）、人參皂苷Re（（C54H92O23）和人參皂苷Rb1（C54H92O23）的總量計，不得少于1.08 mg；每1g 含黃芪以黃芪甲苷（C41H68O14）計，不得少于0.26mg。

表3 各成分加樣回收試驗結果（n ＝6）

表4 18 批樣品各成分含量測定結果（mg ／g，n ＝18）

3 討論

3.1 TLC 條件篩選

人參、黃芪：人參為新增項，黃芪為修訂項。原標準黃芪鑒別采用萃取、洗滌后還需上大孔樹脂柱多溶劑洗脫，操作煩瑣，檢驗周期太長，故對原標準進行優化。人參、黃芪、三七等的皂苷鑒別常使用三氯甲烷－甲醇－水（13 ∶7 ∶2，V／ V／ V）及三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－水（15 ∶40 ∶22 ∶10，V／ V／ V／ V）展開，難以將人參皂苷與黃芪甲苷較好地分離，且色譜條件受環境影響較大，需嚴格控制溫度和濕度，重復性相對較差[4]。根據相關經驗及參考文獻[5]，選擇展開條件。

甘草：原標準以甘草酸銨對照品為對照，甘草陰性對照無干擾，但斑點信息較少，試驗中曾噴以10%硫酸乙醇加熱顯色后再觀察[6]，發現甘草陰性對照有干擾，故參考文獻[7]制訂展開條件。

黃連：原標準中需要二次展開，操作較復雜，且加入黃連對照藥材后，發現陰性對照有干擾，故參考文獻[7]選擇展開條件。

陳皮：修訂時增加了陳皮對照藥材，但在驗證原標準方法時發現陰性對照有干擾。參考2015 年版《中國藥典(一部)》女金丸項下的展開條件[8]521－522，修訂后的方法操作簡便，陳皮陰性對照無干擾，專屬性強。

獨活、白芍 獨活：TLC 原標準的提取方式耗時長，且斑點不清晰，常需加大點樣量，而采用2.1 項下乙醚液揮干后作為供試品溶液，既節省溶劑，減少樣品用量，且斑點又清晰，陰性對照無干擾，方法專屬性強。白芍在原標準基礎上增加了白芍對照藥材，陰性對照無干擾，方法專屬性強。

3.2 TLC 條件考察

各TLC 鑒別均考察了青島海洋化工硅膠G 和Merck 硅膠G60 預制板2 種不同薄層板的層析效果，各成分的Rf值存在一定差異，但與相鄰成分分離度均良好，表明2 種薄層板均能滿足鑒別的要求。另固定薄層板，比較在不同溫濕度條件下展開的薄層效果，結果表明，溫度和相對濕度對薄層色譜效果無明顯影響。

3.3 HPLC 成分及色譜條件篩選

人參的主要有效成分為總皂苷，5 種人參皂苷（Rb1，Rb2，Rg1，Rc，Re）占總皂苷含量的80%，具有延緩疲勞產生的作用，主要表現在調節中樞神經系統、改善機體功能、消除疲勞等方面[9]。黃芪的主要有效成分為黃芪甲苷，黃芪甲苷治療腎性高血壓大鼠時，不僅降壓效果顯著，還可抑制腎氧化應激反應，緩解腎病理損傷[10]。人參、黃芪是益腎化濕顆粒的君藥，其現代藥理作用均與益腎化濕顆粒的功能主治密切相關。因此，對人參皂苷Rg1，Re，Rb1和黃芪甲苷進行定量及定性分析，可更好地控制該制劑的質量。

2015 年版《中國藥典（一部）》中人參含量測定項下人參皂苷的測定波長為203 nm[8]8－9；黃芪含量測定項下黃芪甲苷含量測定采用蒸發光散射檢測器法檢測[8]302－303。最初采用紫外光與蒸發光串聯同步測定，在研究過程中，發現樣品在203 nm 波長處人參分離度較差、陰性對照有干擾，且人參皂苷Rg1，Re，Rb1在蒸發光下響應值也較高，而原標準中在測定人參中的人參皂苷Rb1時也采用蒸發光散射檢測器法，最終確定文中的色譜條件。