C-myc、LSD1、β-catenin蛋白在套細胞淋巴瘤中的表達及臨床意義

鄒宗楷 林燕玲 沈洪武 翁劍鳴 紀思靈

套細胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma，MCL）占非霍奇金氏惡性淋巴瘤的6%左右，主要發生于老年男性，常規化學治療效果差。MCL典型免疫表型通常為Cyclin D1陽性。顯著的分子生物學改變是t（11；14）（q13；q32）易位導致高表達Cyclin D1，研究顯示MCL的發生還有很多分子遺傳學因素的參與[1]。C-myc癌基因位于8q24區，是一種轉錄因子，主要通過基因易位、重組擴增方式活化，在細胞增殖、分化及凋亡方面有重要的生物學功能。惡性淋巴瘤中，C-myc在非霍奇金淋巴瘤（non-hodgkin lymphoma，NHL）細胞中存在不同程度的高轉錄水平，與預后不良有關。組蛋白甲基化或去甲基化是一種重要的可逆性的表觀遺傳修飾方式，參與調控基因結構改變和功能表達。去甲基化酶分為兩個家族：LSD1和含有JmjC結構域的蛋白質。LSD1在多種腫瘤組織中高表達，干擾LSD1能抑制腫瘤細胞增殖。β-catenin是經典Wnt信號轉導通路致癌的關鍵，在細胞黏附和增生過程中均有重要作用。MCL細胞中存在Wnt信號通路β-catenin蛋白異常定位和高表達，其轉移入細胞核后與Tcf/Lef結合，通過組蛋白甲基化啟動了包括C-myc等在內的Wnt信號通路靶基因轉錄激活[2]。本文采用免疫組化檢測MCL組織中C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達，并分析三者之間的相關性以及與臨床病理特征的相關性，為進一步探討三種蛋白異常表達在MCL發生發展中的可能分子機制以及運用siRNA技術進行C-myc基因敲除和功能研究提供初步理論基礎。

1 材料與方法

1.1 臨床材料

收集福建醫科大學附屬漳州市醫院2010年1月—2015年12月收治的30例MCL。其中男性21例、女性9例，年齡51～78歲；結內24例、結外6例，經典型25例、母細胞型4例、多形性型1例；臨床分期：Ⅰ期6例、Ⅱ期9例、Ⅲ期7例、Ⅳ期8例。以30例淋巴結良性病變作為對照組。

1.2 主要試劑與儀器

兔抗人C-myc多克隆抗體、鼠抗人β-catenin單克隆抗體購自福州邁新公司、兔抗人LSD1多克隆抗體購自美國Novus公司。SP試劑盒為福州邁新公司產品。美國羅氏BenchMark全自動免疫組織化學染色儀。

1.3 方法

制作30例MCL和30例淋巴結反應性增生的石蠟病理組織切片，按SP試劑盒說明書行免疫組化染色，以PBS代替一抗作為空白對照，用陽性對照片作為陽性對照。

1.4 判斷標準

采用半定量積分法：根據著色強度和著色細胞所占百分比綜合判斷。（1）按著色強度計分：無著色為0分，輕度為1分，中度為2分，強著色為3分；（2）按著色百分比計分：無陽性細胞為0分，陽性細胞數＜25%為1分，25%～50%為2分，51%～75%為3分，＞75%為4分。將兩項得分結果相加：0分為（﹣），1～2分為（﹢），3～4分為（﹢﹢），5～7分為（﹢﹢﹢）。（﹢﹢﹢）者為陽性高表達。C-myc無陽性細胞為0分，陽性細胞數<10%為1分，10%～30%為2分，＞30%為3分。病理醫師雙盲法進行評估。

1.5 統計學分析

采用SPSS 17.0軟件進行統計學分析。秩和檢驗、卡方檢驗和Spearman相關性分析比較C-myc與LSD1、β-catenin在MCL中表達差異，與Costwolds臨床分期的關系，分析三種蛋白表達之間相關性。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 C-myc與LSD1、β-catenin在MCL中的表達

C-myc與LSD1的陽性產物主要定位在細胞核。β-catenin陽性產物主要定位在細胞質/膜。C-myc在MCL中的陽性高表達率為30%（9/30）（圖1），在對照組陽性高表達率為10%（3/30）（圖2），兩組相比差異有顯著性（P<0.05），LSD1、β-catenin在MCL組的陽性高表達率分別為53.33%（16/30）（圖3）和80%（24/30）（圖5），明顯高于淋巴結反應性增生組中的表達13.33%（4/30）（圖4）和16.66%（5/30）（圖6），P值均＜0.01）。見表1。

2.2 C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達與MCL臨床病理特征的相關性

C-myc的表達與病變部位（P=0.072）、病理組織類型（P=0.082）、臨床分期（P=0.091）均無相關性；LSD1表達與病變部位（P=0.068）、病理組織類型（P=0.078）、臨床分期（P=0.084）均無相關性；β-catenin的表達與病變部位（P=0.075）、病理組織類型（P=0.081）、臨床分期（P=0.093）無相關性。

表1 C-myc、LSD1、β-catenin在MCL中的表達

表2 MCL組織中LSD1、β-catenin與C-myc表達的相關性

2.3 MCL組織中C-myc、LSD1、β-catenin表達的相關性

C-myc與LSD1表達呈正相關（r=0.47），C-myc與β-catenin表達存在正相關發展趨勢（r=0.42），LSD1和β-catenin表達呈正相關（r=0.54）。P值均小于0.05。見表2。

3 討論

近年來，聯合化療及利妥昔單抗等生物靶向治療使套細胞淋巴瘤患者的治療效果顯著提高，但仍有部分患者復發耐藥并最終死亡。MCL病因及發病機制仍不清楚，多個因子異常表達、多個信號通路異常激活與其發生發展有關。

1982年Collins首次在白血病細胞中發現C-myc癌基因擴增現象，它定位于8q24區，是一種轉錄因子，主要通過基因易位、重組擴增方式活化，在細胞增殖及凋亡方面有重要的生物學功能[3]。惡性淋巴瘤中，C-myc在DLBCL細胞存在不同程度的高轉錄水平，與預后不良有關[4]。C-myc在發病率較低的MCL中重排發生率及其預后意義研究尚少，2014年北協和邱錄貴[5]使用FISH方法檢測患者C-myc/8q24，發現C-myc擴增或獲得具有獨立預后不良因素的統計學意義。

LSD1是一個蛋白質賴氨酸脫甲基酶，2004年Shi Y等研究發現在FAD的參與下，LSD1可以使細胞內組蛋白H3K4和H3K9去甲基化，影響細胞生化代謝及增殖凋亡[6]。LSD1可特異性去除p53第370位賴氨酸甲基，抑制p53活性，促進凋亡相關蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表達。課題組前期實驗發現[7-8]：MCL患者腫瘤組織中LSD1蛋白呈高表達狀態，采用RNAi技術下調套細胞淋巴瘤Jeko-1細胞LSD1基因，凋亡相關蛋白Bcl-2、Procaspase3及C-myc表達量減少。

β-catenin在細胞質/膜累積是經典Wnt信號轉導通路致腫瘤的關鍵正性調節因子。基因表達譜分析檢測到MCL細胞中存在Wnt信號通路β-catenin蛋白異常定位和高表達，其轉移入細胞核后與Tcf/Lef結合，通過組蛋白甲基化啟動了包括C-myc等在內的Wnt信號通路靶基因轉錄激活。

圖1 C-myc在MCL高表達，SP法；圖2 C-myc在反應性淋巴結炎低表達，SP法；圖3 LSD1在MCL高表達，SP法；圖4 LSD1在反應性淋巴結炎低表達，SP法；圖5 β-catenin在MCL高表達，SP法；圖6 β-catenin在反應性淋巴結炎低表達，SP法

宋愛琴等[9]應用RNAi技術，經慢病毒載體介導的siRNA轉染Jiyoye細胞，可沉默C-myc基因，抑制細胞增殖，誘導細胞凋亡，揭示沉默C-myc基因在白血病和淋巴瘤靶向治療中的作用。盡管RNAi已廣泛用于腫瘤免疫基因治療方面的研究，但較少RNAi技術沉默C-myc基因治療MCL的文獻研究。

本研究選用30例臨床及病理確診的MCL行免疫組織化學分析發現：患者腫瘤組織中蛋白C-myc、LSD1、β-catenin呈高表達狀態，與對照組相比差異具有顯著性，且C-myc與LSD1、β-catenin蛋白表達呈正相關及正相關發展趨勢（rs=0.47和rs=0.42），LSD1與β-catenin呈正相關（rs=0.54），P值均小于0.05，提示三種蛋白高表達在MCL發生及發展中起一定的促進作用，與有關文獻報道一致[10]。

綜上所述，本實驗從臨床MCL患者病理組織的蛋白水平研究提示C-myc可能通過LSD1和β-catenin調控組蛋白甲基化和Wnt信號通路，但蛋白表達是否與基因異常符合還有待于分子水平進一步研究。小干擾RNA技術廣泛應用，C-myc有望與LSD1、HDAC[11-12]一樣成為人類多種腫瘤靶向藥物研發的新目標，并可能成為精準治療MCL的新方法。