高通量自動化磁珠提取血凝塊DNA的方法研究

潘亭亭 汪偉偉 吉栩

臨床檢驗中血清樣本使用后剩余的血凝塊可以作為重要的樣本資源重新回收、提取DNA進行利用，作為生物樣本進行保存[1]，或者用來進行疾病診斷[2]或基因多態性和功能研究[3-5]。血凝塊DNA提取的方法通常可以分為兩個階段：第一階段通常是血凝塊的勻漿或破碎，常見的方法包括使用手動或電動勻漿器、尼龍網擠壓、剪刀剪碎、研磨棒研磨、加入鋼珠攪拌等方式[6-8]，使血凝塊從一整塊分散成為懸濁液或者是盡可能小的小塊；第二個階段則是將分散后的血凝塊樣本采用不同的方法進行DNA提取，通常是各種血液DNA的提取方法或者是試劑盒，包括使用如酚/氯仿、高鹽沉淀、各種商業化血液提取試劑盒等[6，9-11]。血凝塊的勻漿、破碎可以增加樣本與消化、裂解試劑的接觸面積，有利于DNA釋放。但是文獻所述方法中的手工和勻漿設備等操作[2，6-7]，需要消耗大量的時間和人力，難以高通量同時處理大量樣本，并且需要額外準備器械、適配的耗材等。或者是使用更復雜的試劑處理，試劑體積較大不適合常規自動化提取設備的要求[6-7]。為了實現自動化提取血凝塊DNA，本研究采取流程簡化、效率兼顧的思路，通過對適當大小的血凝塊調整蛋白酶K用量、消化處理的溫度和時間，結合常規血液DNA自動化提取使用的磁珠提取方式，建立高通量自動化的血凝塊DNA提取方法。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 材料和試劑 血凝塊來源于生化檢驗后剩余的血凝塊，采集時間為檢驗結束后1～2天，將血凝塊凍存在-80℃備用。通用型血液/組織DNA磁珠法提取試劑盒購自長春志昂生物科技有限公司，蛋白酶K為試劑盒自帶，濃度為20 mg/mL。提取過程中使用的無水乙醇購自國藥集團化學試劑有限公司。96孔深孔板購自蘇州海貍生物醫學工程有限公司。瓊脂糖購自Biowest。50×TAE緩沖液購自Solarbio DNA Marker購自Takara公司。

1.1.2 儀器和器材 4℃冰箱購自中科美菱，金屬浴、Kingfisher FLEX自動化核酸提取儀、16孔磁力架DynaMagTM-2、臺式離心機Micro21R、Nanodrop 2000 c微量分光光度計購自美國Thermo Fisher公司，核酸電泳儀和水平電泳槽JY-SPCT購自北京君意東方電泳設備有限公司，凝膠成像儀購自英國UVItec公司，電子天平購自德國Sartorius公司。

1.2 方法

1.2.1 血凝塊處理和分割 凍存血凝塊在4℃化凍后使用一次性吸管移去非抗凝采血管中的分離膠，轉移血凝塊至1.5 mL離心管，同時使用手術刀片將血凝塊分割為約0.1～0.2 g的單個血凝塊，稱重記錄處理前血凝塊質量。在篩選優化條件階段，使用6例血凝塊樣本，分成多份血塊后按不同條件進行處理。

1.2.2 血凝塊消化裂解 參考常規血液DNA提取時蛋白酶K用量，為每200～250 μL血液中加入20 μL蛋白酶K（20 mg/mL）?？紤]到非抗凝血的凝固過程，0.1 g血凝塊約來自于原200～250 μL全血，本研究中將每0.1 g血凝塊使用20 μL蛋白酶K定義為1倍消化酶用量。蛋白酶K的用量分別為1倍（1×）和2倍（2×）兩種條件，消化溫度包括4℃、室溫（23±1）℃和37℃。蛋白酶K消化后，加入提取試劑盒中的裂解液65℃加熱裂解10分鐘，10 000 rmp室溫離心2分鐘后吸取上清，轉移至新1.5 mL離心管用于后續手工提取，或轉移至96孔深孔板用于自動化提取。剩余的未消化血凝塊稱重，使用（原血塊質量-剩余質量）/原質量×100%=血凝塊的消化裂解率。不同條件下的消耗裂解率和常溫下1倍蛋白酶K用量消化4小時的效率進行比較分析差異。

1.2.3 磁珠法DNA提取 根據磁珠提取試劑盒流程，在裂解液加入相應的磁珠進行吸附，再分別用洗滌液BW1和80%的乙醇按步驟進行清洗。在優化條件階段使用16孔磁力架進行手工提取。選擇優化條件后，對48個樣品各兩份，共96份樣品使用核酸提取儀Kingfisher FLEX進行自動化提取，參考試劑盒常規設置，調整提取程序為如下步驟：裂解10分鐘，磁珠結合吸附10分鐘，BW1第一次清洗5分鐘，BW1第二次清洗3分鐘，80%乙醇第一次清洗3分鐘，80%乙醇第二次清洗3分鐘，晾干后洗脫10分鐘。最后收集洗脫液轉移至干凈離心管中。

1.2.4 DNA質量分析 對提取所得的DNA用1%的瓊脂糖電泳，觀察提取所得的DNA的條帶是否完整。用分光光度計分析濃度和純度。使用Nanodrop 2000 c測定DNA的濃度，以及260 nm和280 nm下的光密度（OD）比值OD260/OD280。

1.2.5 統計和繪圖 用SPSS 17.0軟件分析統計實驗數據，比較同樣血凝塊來源不同處理條件下的消化裂解效率時，采用配對t檢驗分析不同條件下消化裂解率的差異。對48例血凝塊樣本，通過Pearson相關性分析，分析同一樣品兩份血塊之間提取結果的相關性。P＜0.05表示差異具有統計學意義。繪圖使用GraphPad Prism 5.0。

2 結果

2.1 血凝塊DNA提取條件的優化

2.1.1 不同蛋白酶K用量和溫度下血凝塊消化和裂解效率 將6例血凝塊樣本分成不同的血凝塊小份，使每個小塊大約為0.1～0.2 g，將各份置于不同處理條件下進行蛋白酶K消化和DNA裂解液處理，處理前后均對血凝塊進行稱重，通過（原血塊質量-剩余質量）/原質量×100%計算不同酶量、時間、溫度下的消化裂解效率。處理的條件為：4℃下1×蛋白酶K消化16小時（4-16 h-1×）、4℃下2×蛋白酶K消化4小時（4-4 h-2×）、4℃下2×蛋白酶K消化16小時（4-16 h-2×）；室溫下1×蛋白酶K消化2小時（RT-2 h-1×）、室溫下1×蛋白酶K消化4小時（RT-4 h-1×）、室溫下2×蛋白酶K消化4小時（RT-4 h-2×）；37℃下2×蛋白酶K消化4小時（37-4 h-2×）。不同條件下的消化裂解率如圖1A所示。將不同處理條件下的消化裂解率進行配對T檢驗，除4-16 h-2×、RT-4 h-1×、RT-4 h-2×和37-4 h-2×四個條件下的消化裂解率無差異外，其余條件下，差異具有統計學意義（P＜0.05）。如圖1A所示，可見適當延長消化時間（4℃從4小時延長至16小時，室溫下從2小時延長至4小時）、適當增加蛋白酶K用量（4℃下從1×用量增加至2×用量）可以提高消化裂解率，但對于室溫下處理4小時，增加酶用量效果不顯著。

從提取的DNA單位質量血凝塊DNA產量和DNA總產量來看（圖1B），4℃用1×蛋白酶K消化16小時的單位DNA產出量最高，同時也有較高的DNA總產出量，而4℃用2×蛋白酶K消化的兩組和室溫下用2×蛋白酶K消化4小時組雖然單位產量不高，但都有較高的DNA總產出量，這四組總DNA量差異無統計學意義。綜合消化裂解率和DNA產量，4℃下進行消化和室溫使用2×蛋白酶K消化4小時的效率較有優勢。

2.1.2 處理溫度和時間對DNA完整性的影響 從DNA電泳的結果可以看出（圖1C），在4℃下消化血凝塊提取的DNA基本完整，主帶清晰，僅在消化16小時有個別樣品出現極為輕微的降解。室溫下，處理2小時得到的DNA也基本完整，但是處理4小時就出現了較為明顯的降解帶。在37℃處理時，樣品出現了嚴重的降解。同時未觀察到蛋白酶K濃度對DNA的降解有影響。因此，控制消化的溫度和時間對獲得完整的DNA有重要影響。

2.2 高通量自動化提取的效果

96份血凝塊總體的平均消化裂解率都在70%以上，OD260/280平均值在1.70以上，基本符合預期1.7～1.9的參考范圍。抽樣電泳顯示各樣本條帶完整，DNA基本無降解（圖片未出示）。DNA的單位產量（每0.1 g血凝塊產出DNA量）均值在4 μg左右，總量的均值在5 μg上下，均在預期范圍內（表1）。對兩份樣品對應的參數進行相關性分析，除OD260/280之外消化裂解率、單位產量和總量均有相關性。兩份樣本消化裂解率相關性P值為0.004，相關系數0.409，而單位產量兩份樣本的相關系數為0.912，兩份樣本總量的相關系數為0.881，P值均小于0.001，說明對于同一例樣本進行兩次提取的結果非常相近，提取方法的可重復性好。

3 討論

圖1 不同處理條件下血凝塊提取效果比較

表1 48例血凝塊樣本分兩份提取效果的比較

本研究選擇一種通用且簡化的方式來實現高通量自動化提取血凝塊DNA。雖然未對血凝塊大小進行分析，但根據以往經驗，較大的血凝塊不利于處理，而且需要消耗更多的蛋白酶K、DNA裂解液等試劑。同時對血凝塊中殘留的血液進行提取，得到的DNA含量低，不能滿足常規實驗需求（結果未出示）。參考常規全血提取DNA需要的血液量，我們將單份提取的血凝塊大小限制為約0.1～0.2 g。從消化裂解的效率看（圖1A），2倍酶量相比1倍酶量對于較短處理時間的消化裂解率有提升，但在較長的處理時間下效率提升幅度較小。從DNA產出量來看（圖1B），較長的消化時間有利于DNA的釋放，較高的消化酶用量并不直接和更高的DNA產率相關，可能是相對過量的酶對于效率的提升作用有限，或是受DNA提取效率影響。在王琦等[10]的研究中發現，對于250 μL全血使用濃度為18.8～19.0 mg/mL的蛋白酶K效果最佳，因此可以根據實際工作和成本控制的需要，選擇1～2倍之間的蛋白酶K進行消化。

從DNA的完整性來看，消化處理時的溫度非常重要，37℃會造成DNA的嚴重降解，室溫處理的時間也需要嚴格控制。其他研究中報道對牛血液、牛乳進行DNA提取時，4℃提取所得DNA質量優于室溫提取[12-13]。結合本研究，4℃是血凝塊提取的優選條件，如果選擇室溫下進行消化，建議控制時間在2小時左右。

根據文獻中方法，勻漿器勻漿需要使用一次性耗材，否則容易導致樣品的交叉污染[8]，增加了額外的耗材成本。在Mardan-Nik使用的方法中，在樣品中放入金屬的攪拌器材，并且使用了較大體積500 μL的提取試劑[7]，和常規的反應體系存在差異，這些參數和自動化設備的要求相沖突。本研究中蛋白酶K消化的操作屬于極為普遍的操作，不需要特殊試劑和耗材，適用性好。消化時間也可以根據需要進行調整，即使需要4℃過夜消化，也不會額外增加對人力操作的需求。

以常見的Qiagen的DNA Blood Mini試劑盒為例，單次提取可從200 μL新鮮全血中得到4～12 μg的DNA，本研究從相當于200 μL左右全血的0.1 g血凝塊中，平均可以獲得的DNA約4 μg，提取效率和常規方法可以相比較。自動化提取的結果可以看到有一些樣本的提取效率不高，這可能和樣本初始的狀態、個體的差異以及血凝塊的不均一有關。但絕大部分單份樣品可以得到0.5 μg以上的DNA，可滿足常規單次全基因組測序的要求。值得注意的是有一些樣品OD260/280稍微偏低，可能由于蛋白等雜質造成，因此目前的自動化提取程序還可以進一步優化以提高DNA的純度。