基于HPLC 法測定秦艽-威靈仙藥對水煎液的環烯醚萜苷類成分

吳 晨，魏 昀，高慧琴

（甘肅中醫藥大學藥學院，甘肅蘭州730000）

秦艽（Gentiana macrophylla Pall.）為龍膽科植物秦艽的干燥根，威靈仙（Clematis chinensis Osbeck.）為毛茛科植物威靈仙的干燥根和根莖［1］。秦艽和威靈仙二藥均具有祛風濕之功效［2］。環烯醚萜類化合物苷元具有抗炎、止血、鎮痛等功效，可分為獐牙菜苦苷類、龍膽苦苷類和獐牙菜苷類等［3-4］。本研究首先通過網絡藥理學檢索秦艽-威靈仙藥對中含有的環烯醚萜苷類有效成分，接著通過高效液相色譜法（High performance liquid chromatography，HPLC）對秦艽-威靈仙藥對水煎液成分進行分析，最終將色譜分析結果與網絡藥理學檢索結果進行比對，判斷通過網絡藥理學檢索秦艽-威靈仙藥對水煎液成分結果的準確性，為網絡藥理學相關研究提供參考。

1 材料與方法

1.1 軟件數據庫

中藥系統藥理學分析平臺［5］（TCMSP，http：//lsp.nwu.edu.cn/tcmsp.php） 和 Cytoscape 3.2.1 分析軟件（https：//cytoscape.org）。

1.2 藥品與試劑

秦艽和威靈仙飲片購自蘭州惠仁堂藥店，批號分別為16062901 和16061406，經甘肅中醫藥大學中藥鑒定教研室李成義教授鑒定為正品。標準對照品：獐牙菜苦苷（批號：CHB181105）、龍膽苦苷（批號：CHB190130）和獐牙菜苷（批號：CHB180115），純度均≥98%，購自成都克洛瑪生物科技有限公司。甲醇（色譜純）購自美國Sigma公司；磷酸（色譜純）購自天津大茂化學試劑廠；蒸餾水購自廣州屈臣氏食品飲料有限公司。

1.3 實驗儀器

1260 系列高效液相色譜儀配 G7115A DAD檢測器（美國Ailent Technologies 公司）；KQ-700DE型超聲波清洗機（昆山市超聲儀器有限公司）；ME204E 型分析天平（瑞士METTLER TOLEDO 國際貿易上海有限公司）；MYB 型電子調溫電熱套（天津市中實驗電爐有限公司）。

1.4 實驗方法

1.4.1 藥對活性成分篩選與收集 依次以“秦艽”和“威靈仙”為關鍵詞通過 TCMSP 數據庫檢索各味藥的活性成分，以生物口服利用度（Oral bioavailability，OB）≥30%和類藥性（Drug-likeness，DL）≥0.18 作為篩選標準［6］，匯總整理秦艽-威靈仙藥對的活性成分，并通過Cytoscape 構建“中藥-成分”網絡拓撲圖，篩選環烯醚萜苷類成分。

1.4.2 色譜條件 色譜柱為：安捷倫883975-902 ZORBAX SB-C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動相 A 為 0.04%磷酸水溶液（0～28 min，85%A→77%A；28～35 min，77%A→65%A）、流動相 B 為甲醇，色譜柱采用梯度洗脫（0～28 min，15%B→23%B；28～35 min，23%B→35%B）；流速設置為 0.8 mL/min；柱溫箱設置為30 ℃；檢測波長設置為245 nm；進樣量設置為 5 μL。

1.4.3 標準對照品和藥品的制備 標準對照品溶液的制備：分別精密稱取獐牙菜苦苷5.0 mg、龍膽苦苷10.6 mg 和獐牙菜苷3.1 mg，分別置于3 個10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得對應高濃度標準對照品溶液。

混合標準對照品溶液的制備：分別精密量取1 mL 獐牙菜苦苷、1 mL 龍膽苦苷和1 mL 獐牙菜苷標準對照品溶液，置于1 個10 mL 容量瓶中，加甲醇定容至刻度，制得混合標準對照品溶液。其濃度分別為：獐牙菜苦苷0.050 0 mg/mL、龍膽苦苷0.106 0 mg/mL 和獐牙菜苷0.031 0 mg/mL，置于4 ℃冰箱儲存備用。

通過冷凝回流法制備秦艽-威靈仙藥對水煎液，按照秦艽：威靈仙1∶1 的比例分別稱取秦艽飲片和威靈仙飲片各5 g 共10 g，分2 次煎煮。第1次加 10 倍量水（100 mL），浸泡 30 min 后，加熱至沸騰后再煎煮1 h，紗布過濾收集藥液；第2 次加8倍量水（80 mL），加熱至沸騰后再煎煮30 min，紗布過濾收集藥液，合并濃縮2 次水煎液，定容至100 mL，得到濃度為0.1 g/mL 的秦艽-威靈仙藥對水煎液。將以上制得中藥水煎液通過0.45 μm 濾器過濾，置于-20 ℃冰箱儲存備用。

1.4.4 適應性實驗 設定HPLC 色譜儀精密吸取混合對照品溶液和供試品溶液各5 μL，在“1.4.2項”色譜條件下分別進樣進行適應性測定。

1.5 線性關系

設定HPLC 色譜儀分別精密吸取標準對照品溶液 2.5 μL、5 μL、10 μL 和混合標準對照品溶液各 1.25 μL、2.5 μL、5 μL、10 μL、12.5 μL 進樣，按步驟“1.4.2 項”的色譜條件測定峰面積，以對照品進樣量（μg）為 X 軸，峰面積值為 Y 軸，繪制標準曲線，并得到線性回歸方程和線性范圍。

1.6 精密度實驗

設定HPLC 色譜儀，分別精密吸取混合標準對照品溶液5 μL，連續進樣7 次，記錄分析色譜圖并計算混合標準對照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.7 重復性實驗

稱取秦艽 5 g，威靈仙 5 g，共10 g，設置為7 組平行，按“1.4.3 項”方法制備 7 份平行秦艽-威靈仙藥對水煎液的供試品溶液，設定HPLC 色譜儀分別精密吸取5 μL 供試品溶液進樣檢驗，在“1.4.2 項”色譜條件下分析藥對水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苦苷含量的RSD 值。

1.8 穩定性實驗

取同一份秦艽-威靈仙藥對水煎液供試品溶液，設定HPLC 色譜儀精密吸取5 μL 供試品溶液，在“1.4.2 項”色譜條件下進樣測定 0 h～24 h 內每隔2 h 的獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積，并計算RSD 值。

1.9 加樣回收率實驗

量取已知成分含量的秦艽-威靈仙藥對水煎液供試品溶液6 份，分別加入一定量的獐芽菜苦苷對照品、龍膽苦苷對照品和獐牙菜苷標準對照品，在“1.4.2 項”色譜條件下分別進樣 5 μL，記錄色譜峰，計算加樣回收率。

1.10 樣品含量測量

取秦艽和威靈仙飲片按“1.4.3 項”方法平行制備5 份供試品溶液，在“1.4.2 項”色譜條件下進樣5 μL，測量獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的峰面積并代入“1.5 項”中的線性回歸方程以計算獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的含量。

2 結 果

2.1 藥對活性成分篩選與收集結果

以關鍵詞“秦艽”和“威靈仙”于TCMSP 數據庫檢索活性成分，共檢索到：秦艽27 個成分，威靈仙57 個成分。根據步驟2.1 中標準篩選后，秦艽-威靈仙藥對共篩得13 個活性成分，其中屬于秦艽的活性成分6 個，屬于威靈仙的活性成分7 個，共有活性成分2 個，分別是齊墩果酸和β-谷甾醇（表1）。通過Cytoscape 構建網絡拓撲圖（圖 1），篩選得到藥對中的環烯醚萜苷類成分有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷。

表1 秦艽-威靈仙藥對活性成分及相關參數

圖1 秦艽-威靈仙藥對“中藥-活性成分”拓撲圖

2.2 適應性實驗結果

以“1.4.4 項”方法進樣檢測的HPLC 色譜圖見圖2，結果可見獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的保留時間分別為 25.6 min、30.5 min 和 34.6 min，峰分離度良好。

2.3 線性關系結果

將“1.5 項”方法檢測所得數據繪制標準曲線，以對照品進樣量（μg）為X 軸，峰面積值為Y 軸，最終得到線性回歸方程。獐牙菜苦苷的線性回歸方程為 Y=507X+5.531 8（R2=0.998 2）；龍膽苦苷的線性回歸方程為Y=713.23X+12.219（R2=0.998 9）；獐牙菜苷的線性回歸方程為Y=296.12X+8.881 6（R2=0.997）。分析結果發現：獐牙菜苦苷在0.021 0～1.056 0 μ g，龍膽苦苷在 0.036 5～11.720 0 μg 以及獐牙菜苷在 0.016 2～1.142 0 μg 范圍內線性關系良好。

圖2 高效液相色譜圖

2.4 精密度結果

以“1.6 項”方法分析色譜圖并計算混合對照品溶液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為0.42%、0.24%和1.79%，表明實驗精密度良好。

2.5 重復性結果

以“1.7 項”方法檢測分析秦艽-威靈仙藥對水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別為1.21%、0.07%和0.49%，表明實驗具有較好重復性。

2.6 穩定性結果

以“1.8 項”方法，每隔 2 h 檢測 1 次，24 h 內秦艽-威靈仙藥對水煎液中獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷含量的RSD 值分別2.32%、0.33%和1.89%，表明樣品在24 h 內具有良好穩定性。

2.7 加樣回收率結果

以“1.9 項”方法檢測并計算秦艽-威靈仙藥對水煎液的加樣回收率，獐牙菜苦苷的平均加樣回收率為 99.64%（表2）、龍膽苦苷的平均加樣回收率為100.20%（表3）以及獐牙菜苷的平均加樣回收率為 101.11%（表4）。

2.8 樣品含量測量結果

表2 獐牙菜苦苷加樣回收結果

表3 龍膽苦苷加樣回收結果

表4 獐牙菜苷加樣回收結果

以“1.10 項”方法檢測并將峰面積代入線性回歸方程計算秦艽-威靈仙藥對水煎液中獐芽菜苦苷、龍膽苦苷峰和獐牙菜苷的含量分別為2.13 mg/g、28.36 mg/g 和 4.51 mg/g。

3 討 論

獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷既是環烯醚萜苷中的裂環環烯醚萜苷類成分，也是秦艽-威靈仙藥對發揮藥效的物質基礎之一［7-8］。近年來，網絡藥理學的發展方興未艾，但是由于其所得結果多數基于數據庫查詢和軟件分析并且只能定性不能定量［9］，其結果也備受爭議。本研究借助HPLC法對通過網絡藥理學方法檢索得到的秦艽-威靈仙藥對水煎液中含有的環烯醚萜苷類成分結果進行定性檢測并確定了其含量，驗證了網絡藥理學在預測秦艽-威靈仙藥對水煎液成分方面的可行性，進而推廣到預測其他中藥的活性成分，為網絡藥理學提供實驗數據支撐。

本研究使用紫外全波長掃描（190 nm～400 nm），查閱文獻發現：獐芽菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的最大吸收波長分別為235 nm、270 nm和247 nm，因吸收波長在245 nm 處獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷色譜峰的靈敏度較高且雜質干擾較少，故選擇245 nm 作為本研究的檢測波長。通過查閱文獻并結合不同溶劑流動相考察的實驗發現，較乙腈-磷酸水溶液來說，甲醇-磷酸水溶液作為流動相有助于各峰之間的完全分離，獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷的分離效果較好，色譜圖基線較平穩。因為本研究輔助課題組藥效學研究，故選擇了與藥效研究相同的水煎液制備方法，以期其結果對藥效學實驗具有指導作用［10］。

最終實驗結果表明，秦艽-威靈仙水煎液中含有獐牙菜苦苷、龍膽苦苷和獐牙菜苷這3 種環烯醚萜苷類成分，與網絡藥理學預測結果一致，其含量按順序排列為：龍膽苦苷（28.36 mg/g）＞獐牙菜苷（4.51 mg/g）＞獐牙菜苦苷（2.13 mg/g）。本研究從基礎的儀器分析方法入手，以秦艽-威靈仙藥對為例，考察了網絡藥理學中有效成分查詢方法的可靠性，彌補了網絡藥理學預測成分只能定性不能定量的缺陷，為日后基于網絡藥理學研究中藥藥性理論或是作用機制提供了新的思路。