甜蕎多糖提取工藝的優化及其顆粒劑的制備

張育貴，吳紅偉，李東輝，張淑娟，辛二旦，牛江濤，司昕蕾，李越峰

（甘肅中醫藥大學，甘肅省中藥質量與標準研究重點實驗室，甘肅蘭州730099）

蕎麥是廖科蕎麥屬蕎麥的種子，其栽培品有普通蕎麥（甜蕎）和韃靼蕎麥（苦蕎）兩種［1］。蕎麥被認為是傳統的保健佳品，富含高蛋白、多糖、黃酮、植物甾醇、肌脂等成分［2］，有開胃寬腸、下氣消積的功效，用于治療絞腸痧、腸胃積滯、慢性泄瀉等，也可預防高血脂、高血糖、高血壓等。蕎麥多糖為主要的功能性成分，是國內外研究的熱點；大量研究表明，蕎麥多糖除具有抗氧化、抗腫瘤、清除自由基等藥理作用外［3-5］，還能夠為生物體提供能量，是構建細胞壁的主要成分，同時還具有保護生物體的功能［6］。本實驗采用水提醇沉法優化甜蕎多糖的最佳提取工藝，并制備其顆粒劑，為后續開發和利用提供基礎。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

甜蕎麥（Fagopyrum esculentum Moench.），來源于蓼科植物蕎麥的干燥成熟種子。本研究所用的甜蕎采自陜西定邊，經甘肅中醫藥大學藥學院中藥鑒定教研室王明偉副教授鑒定為正品。

1.2 試劑與儀器

如表1、表2 所示。

1.3 方法與結果

1.3.1 標準溶液的制備 精密稱取無水葡萄糖對照品0.010 0 g，置50.00 mL 容量瓶中，純水溶解，超聲，定容至刻度線，即得葡萄糖標準溶液。

表1 實驗試劑及批號

表2 實驗儀器及型號

1.3.2 最大吸收波長的確定 準確吸取葡萄糖標準溶液0.20 mL 于10.00 mL 的容量瓶中，加入5%苯酚溶液1.50 mL，濃硫酸7.50 mL，定容，60 ℃水浴加熱20 min 后流水冷卻，紫外分光光度計400～600 nm 范圍內掃描，測得最大吸收波長為490 nm。

1.3.3 標準曲線繪制 依次準確吸取葡萄糖標準溶液 0 mL、0.1 mL、0.2 mL、0.3 mL、0.4 mL、0.5 mL、0.6 mL、0.7 mL 于 10 mL 容量瓶中，按“1.3.1”項下方法制備待測液，以0 mL 標準液管為空白對照，在490 nm 處測定吸光度。如圖1，在濃度為0.002～0.014 mg/mL 時，吸光度與濃度呈良好的線性關系，回歸方程 Y=66.601X-0.053 6（R2=0.998）。

圖1 葡萄糖標準曲線

1.3.4 方法學考察

1.3.4.1 精密度實驗 精密量取6 份質量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標準液 0.2 mL，按“1.3.2”方法連續測定吸光度值并計算，結果得RSD 為0.38%，表明儀器精密度良好。

1.3.4.2 重復性實驗 精密量取質量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標準液 0.2 mL 6 份，按“1.3.2”方法分別測定吸光度值并計算，結果得RSD 為0.73%，表示該方法重復性良好。

1.3.4.3 穩定性實驗 精密量取質量濃度為0.01 mg/mL 的葡萄糖標準液，分別放置 0 h、2 h、4 h、6 h、8 h、12 h 各取 0.2 mL 按“1.3.2”方法測定吸光度值并計算，結果得RSD 為1.2%，表明樣品穩定性較好。

1.3.4.4 加樣回收率實驗 精密量取6 份0.9 mg/mL 的定邊甜蕎多糖提取液0.1 mL，分別加入一定量葡萄糖對照品，測定吸光度值，計算回收率，如表3。平均回收率為98.13%，RSD 值為1.03%，表明該方法回收率良好。

表3 加樣回收率實驗結果 （n=6）

1.3.5 甜蕎多糖提取工藝 定邊甜蕎粉末20 g（40 目篩）→80%乙醇回流→抽濾→取濾渣→水回流提取→4000 r/min 離心10 min→取上清液，濃縮至25 mL→3 倍量95%乙醇沉淀→靜置24 h→4000 r/min 離心7 min→棄上清液→沉淀加水溶解→定容至250 mL 備用。

1.3.6 單因素試驗 影響甜蕎多糖提取工藝的主要因素為提取溫度、提取時間、料液比，本試驗對這3 個因素進行考察［7］，單因素試驗方法設計如表4。

表4 單因素試驗設計表

1.3.7 均勻設計試驗［8］在單因素試驗的基礎上，以吸光度大小為指標，用U5（53）均勻設計試驗確定提取時間、提取溫度、料液比的最佳組合，從而優化甜蕎多糖提取工藝。均勻設計的因素水平如表5。

1.3.8 蕎麥多糖顆粒劑的制備及質量測定［9-10］

1.3.8.1 制備方法 將可溶性淀粉、糊精研磨成細粉，過50 目篩備用。精確稱取含水量為18%的蕎麥多糖6 g，按一定比例加可溶性淀粉和糊精共18 g 充分混勻，加70%乙醇制軟材，經14 目篩制粒，60 ℃干燥3 h，整粒，篩除細粉，即得蕎麥多糖顆粒，處方比例見表6。

表5 均勻設計因素水平表

表6 處方比例

1.3.8.2 顆粒劑主要質量指標的測定方法 ①溶解性測定：精密稱定表中各處方顆粒0.5 g 加入干燥至恒重的15 mL 離心管中，精密加入沸水10 mL，攪拌振蕩5 min，4000 r/min 離心10 min，棄去上清液，在80 ℃將殘渣烘干至恒重，精密稱定，計算溶化率［溶化率（%）=溶化顆粒質量/總顆粒質量×100%］。以溶化率100%為25 分，依此類推計算得分。②成型性測定：取各處方樣品20 g，分別依次通過1 號篩與4 號篩，以合格顆粒（能通過1 號篩但不能通過4 號篩的顆粒）的質量與樣品質量的比為成型率。以成型率100%為25 分，以此類推計算得分。③吸濕性測定［11］：稱取各處方顆粒約2 g，精密稱重，放入已恒重的稱量瓶中，置于相對濕度75%（氯化鈉飽和溶液密閉24 h 可獲得）條件下，24 h 后取出，精密稱定扁形稱量瓶與樣品的質量，測定吸水量，計算吸濕率［吸濕率=（吸濕后顆粒質量-吸濕前顆粒質量）/吸濕前顆粒質量×100%］。以吸濕率0%為50 分，對各處方進行扣分，計算各處方分值。

2 結 果

2.1 單因素試驗結果分析

2.1.1 提取時間對蕎麥多糖含量的影響 料液比為1∶15、提取溫度為80 ℃的條件下，考察不同提取時間 1 h、1.5 h、2 h、2.5 h、3 h 對蕎麥多糖含量的影響。結果見圖2。

圖2 提取時間對蕎麥多糖含量的影響

由圖2 可知，隨著提取時間的不斷增加，蕎麥多糖的提取效果呈升高的趨勢，在3 h 時提取效果最好，從2.5 h 至3 h 之間變化幅度不大，增加趨勢較為平緩，故選取3 h 為最佳提取時間。

2.1.2 提取溫度對蕎麥多糖含量的影響 料液比為1∶15、提取時間3 h 的條件下，考察不同提取溫度 60 ℃、70 ℃、80 ℃、90 ℃、100 ℃對蕎麥多糖含量的影響。結果見圖3。

圖3 提取溫度對蕎麥多糖含量的影響

由圖3 可知，隨著提取溫度不斷升高，蕎麥多糖的提取率呈不斷增大的變化趨勢，在90 ℃提取效果最好，從80 ℃到90 ℃變化趨勢變小，若再增加溫度，提取率變化不大，故選取90 ℃為最佳提取溫度。

2.1.3 料液比對蕎麥多糖提取效果的影響 提取時間3 h、提取溫度為90 ℃的條件下，考察不同料液比 1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25 對蕎麥多糖含量的影響。結果見圖4。

圖4 料液比對蕎麥多糖含量的影響

由圖4 可知，隨著料液比不斷增加，蕎麥多糖的提取率呈不斷增大的趨勢，料液比為1∶20 時提取效果最好，故選取1∶20 為最佳提取料液比。

2.2 甜蕎多糖含量提取均勻試驗

在預試驗基礎上，以提取時間（X1）、提取溫度（X2）、料液比（X3）為考察因素，以定邊甜蕎多糖含量（Y，多糖含量＝供試品溶液中多糖質量濃度×供試品溶液總體積/藥材質量）為評價指標，選用均勻設計表U5（53）設計試驗方案。稱取定邊甜蕎粉末5 份，每份20.00 g，按“1.3.1”項下方法處理，測定樣品中多糖含量。

按U5（53）表安排的試驗方案測定甜蕎多糖含量，每個試驗重復3 次，試驗結果見表7。

表7 均勻試驗結果 （n=3）

利用SPSS 19.0 軟件對試驗數據進行二次多項式回歸分析處理，可得到Y 與料液比（X1）、提取時間（X2）、提取溫度（X3）的回歸方程為：

Y=0.016 37-0.424 9X1+0.048 2X2+0.067 0X3（R2=0.992 5，F=44.092 7>F0.25（3，1）=8.20）

通過檢驗，回歸方程有意義。利用單因素輪換法求回歸方程的極大值（最優值），其結果如下：料液比為1∶10，提取時間為2 h，提取溫度為80 ℃。按優化條件再次進行試驗，其結果為12.27 mg/g，與預測值基本相符，表明優化條件可信。

2.3 多糖顆粒劑的制備

2.3.1 溶解性測定 結果見表8。

表8 溶解性測定結果

2.3.2 成型性測定 結果見表9。

表9 成型性測定結果

2.3.3 吸濕性測定 結果見表10。

表10 吸濕性測定結果

2.3.4 綜合評價 結果見表11。

表11 顆粒劑處方綜合評價表

以多糖部位浸膏為原料，采用可溶性淀粉和糊精作為輔料，蕎麥多糖部位與可溶性淀粉和糊精比例為2∶1∶5，并使用70% 乙醇作為潤濕劑進行顆粒劑的制備，所得顆粒劑成型性、流動性好且不易粘連，溶化速度快且靜置后無沉淀。

3 討 論

本試驗最后得到的甜蕎多糖最佳提取工藝為10 倍量水在80 ℃下提取120 min，該條件下提取多糖含量實測值為12.27 mg/g；優化得到的最佳制粒工藝蕎麥多糖、可溶性淀粉和糊精用量比例為2∶1∶5，并使用70%乙醇作為潤濕劑制得顆粒劑成型性、流動性好且不易粘連，溶化速度快且靜置后無沉淀。

本研究探討水提醇沉法對定邊甜蕎多糖的提取條件及影響因素，確定最佳提取工藝。但是蕎麥多糖屬于復合性多糖，其具體結構尚不清楚，而在多數測定多糖的試驗當中以葡萄糖為標準品測量結果只能作為參考，因此，在后期的開發研究中可以向研究蕎麥多糖的結構及測量多糖含量方向發展。

蕎麥多糖具有增強免疫、抗氧化、肝損傷保護、中樞抑制、鉛中毒保護等作用［12-14］。谷仿麗等［15］發現蕎麥多糖能使模型小鼠脾臟系數、吞噬指數、半數溶血值、胸腺系數及足趾厚度差等指標顯著提高，表明其具有較好的免疫增強作用。同時有研究表明，苦蕎多糖對超氧陰離子、羥基自由基有明顯的抑制作用［16］。張季等［17］研究發現，苦蕎麥多糖可顯著降低鉛中毒小鼠組織和血漿中的鉛含量，并顯著提高鉛中毒小鼠組織和血漿中超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽過氧化物酶（GSH-Px）活力，降低丙二醛（MDA）含量，表明苦蕎麥多糖可通過提高抗氧化酶活性和清除自由基，從而改善鉛中毒造成的損傷。基于此，蕎麥多糖具有較高的開發價值，同時本研究發現陜西定邊擁有大量的甜蕎資源，利用最優的條件提取多糖并開發出顆粒劑作為新的保健食品及醫藥產品對于今后利用其預防和治療人類疾病具有積極的研究價值。