血管緊張素Ⅱ通過激活小G蛋白Rac1上調Fgf13促進大鼠心臟成纖維細胞的增殖遷移

楊振偉 蔣靜涵 謝東輝

皖南醫學院第一附屬醫院急診科，安徽蕪湖 241000

心房顫動（atrial fibrillation，AF）又稱房顫，是 臨床常見的心律失常之一，現在已經成為心血管疾病中的一大流行性疾病，嚴重影響患者的預后及生活質量[1-2]。隨著對AF機制研究的不斷深入，研究者發現心房結構重塑在房顫病理性進程中發揮著重要作用，而心房纖維化則是心房結構重塑的基礎[3-4]。纖維化進展的關鍵在于細胞外基質在組織間隙的沉積，細胞外基質主要包括膠原蛋白（Ⅰ型及Ⅲ型）、細胞纖連蛋白和基底膜蛋白如層黏連蛋白等。研究表明成纖維細胞在纖維化進展中起著重要作用，通過增殖、遷移及調節細胞外基質（ECM）的代謝，參與調節纖維化。并可轉化為肌成纖維細胞，更有效地合成細胞外基質，肌成纖維細胞可表達α-平滑肌肌動蛋白（α-SMA）促進心臟纖維化[5]。大量研究表明，RAS系統的激活在心房纖維化發生發展中發揮著重要作用，當RAS系統被激活后主要活性效應分子是AngⅡ[6-7]，AngⅡ通過與細胞G蛋白偶聯的AngⅡ的Ⅰ型受體（AT1R）相結合，激活主要激活絲裂原活化蛋白激酶家族（MAPKs）信號通路促進纖維化進程[8]。相關C3肉毒梭菌毒素1（Rac1），是小三磷酸鳥苷酶結合蛋白，屬于Ras超家族中Rho亞家族的成員。既往研究發現Rac1在心房纖維化過程中發揮重要作用[9]。Liu等[10]發現，AngⅡ可以激活Rac1，且活化型Rac1的表達水平的升高可促進心房纖維化。Rac1-V12是Rac1的人工突變體，具有持久性生物活性，可模擬病理狀態下活化型Rac1[11]，纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor，Fgf）是一組多肽形成纖維細胞的有絲分裂原，具有促進血管、骨形成和損傷修復的功能[12]。最近發現Fgf家族在調節心臟功能中的作用，其中Fgf21、Fgf23與房顫發生發展呈正相關，具有促進心房纖維化的作用[13-14]，Fgf13是嚙齒動物心臟中最主要的纖維細胞生長因子，也是人類心臟中常見的轉錄本，參與調節心臟的電壓門控Na+離子通道[15-16]，近期發現Fgf13在心臟肥厚的調節中發揮重要作用[17]。而其在心房纖維化方面尚無相關研究。本研究將初步探索Fgf13在AngⅡ激活小G蛋白Rac1促進心臟成纖維細胞增殖、遷移過程中的作用。

1 材料與方法

1.1 材料

胎牛血清、DMEM培養基、0.25%EDTA-胰蛋白酶（美國Gibco公司），Ⅱ型膠原酶購于美國Worthington Biochemical公司；Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12等腺病毒表達載體購自中國山東維真生物科技有限公司；血管緊張素Ⅱ（美國 Sigma-Aldrich 公司）；GAPDH兔多克隆抗體、Ⅰ型膠原蛋白（CollagenⅠ）兔多克隆抗體、α-SMA鼠多克隆抗體、Rac1兔多克隆抗體、Fgf13兔多克隆抗體購自ABclonal公司；山羊抗兔二抗、SDS-PAGE凝膠試劑盒、SDS-PAGE蛋白上樣緩沖液購自中國碧云天公司；PVDF膜和ECL發光液中國碧云天公司細胞培養箱購自美國Thermo公司。其他生化試劑均為進口分裝或國內分析純化。

1.2 方法

1.2.1 大鼠心臟成纖維細胞（atrial fibroblasts，AFs）原代細胞的分離和培養 取2～3日齡SD乳鼠6～10只（上海吉輝公司；SPF級），取出乳鼠心臟置于培養皿中用眼科剪將心臟剪成約1mm×1mm×1mm的組織塊，再加9.6mL PBS緩沖液和400μL 0.25%胰酶（美國Gibco公司），輕輕搖晃均勻，將培養皿置于4℃冰箱（中國海爾）過夜。次日轉入離心管中，離心去上清，補充高糖完全培養基至14mL，加入1mL的0.1%Ⅱ型膠原酶，37℃水浴消化25～28min。消化后再次離心棄上清，再次用高糖完全培養基重懸細胞沉淀，取適量放入培養皿中，5%CO2、37℃培養箱中培養。差速貼壁培養60min后，用吸管吸去富含未及時貼壁的心肌細胞的培養基，留下了貼壁的AFs，加入和培養皿相適應的高糖完全培養基繼續生長，每隔24h更換一次培養基。

1.2.2 小干擾RNA的合成及轉染 小干擾RNA由北京擎科生物科技有限公司設計并合成。序列如 下：Si-Fgf13：CGUGUGUUUAAAUAAGAAAUG UUUCUUAUUUAAACACACGAG。小干擾轉染AFs：將原代成纖維細胞鋪入6孔板，當細胞融合度達到30%時，參照Lipofecta-mineTM2000轉染試劑說明書，使用LipofectamineTM 2000將siRNA和陰性對照轉入細胞。將被轉入細胞分為Si-Fgf13組及陰性對照組，并在轉染6h后更換培養基。

1.2.3 CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs增殖和遷移能力 將AFs鋪入做好標記的六孔板中，分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組、Ad-Rac1-V12-Si-Fgf13組，長滿后，用10μL移液槍槍頭垂直標記線做劃痕，PBS洗三遍，更換無血清或低濃度血清（≤2%）培養基，定時于顯微鏡下拍照。在96孔板中接種密度合適的AFs，穩定生長24h后，按上述分組轉染細胞。24h后每孔加入培養液總體積10%的CCK8（中國碧云天公司），混勻培養4h后檢測450nm處的吸光度（OD）值。

1.2.4 Western Blot免疫印跡檢測蛋白水平 將處理好的AFs用PBS洗滌3次，加入強RIPA裂解液（中國碧云天公司），置冰上30min，然后轉移至新的EP管中離心10min。取上清液，用BCA蛋白檢測試劑盒（中國碧云天公司）檢測總蛋白，按比例加入5x上樣緩沖液95℃煮沸10min。取20μg蛋白進行SDS-PAGE，然后將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，加入相應的一抗[anti-Collagen Ⅰ、anti-α-SMA、anti-Fgf13、anti-Rac1、anti-GAPDH均為（1∶1000）]4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP二抗（1∶1000），室溫搖床孵育1h，以GAPDH為內參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量用化學發光成像分析儀對條帶進行分析。

1.2.5 GST pull-down實驗 將AFs分為兩組：Control組及AngⅡ組，細胞鋪盤穩定生長后，AngⅡ組予以AngⅡ處理48h后提取蛋白。將兩組蛋白分別加入預處理的GSTbeads（美國Sigma-Aldrich公司）共孵育，通過結合GSTbeads，下拉目的蛋白，獲取純化的目的蛋白[18]。將獲取的純化蛋白按比例加入5x上樣緩沖液95℃煮沸10min。取20μg蛋白進行SDS-PAGE電泳分析，然后將蛋白轉移到PVDF膜上。用5%的脫脂奶粉室溫封閉1h，加入相應的一抗（anti-Rac1）4℃搖床孵育過夜，TBST洗膜后加入HRP二抗（1∶1000），室溫搖床孵育1h，以Input為參照，掃描灰度值并分析蛋白表達相對含量用化學發光成像分析儀對條帶進行分析。

1.3 統計學處理

應用SPSS22.0統計學軟件進行數據分析。計量資料以（x±s）表示，兩組間比較采用獨立樣本t檢驗。多組間比較采用單因素方差分析（one-away ANOVA）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 AngⅡ激活的Rac1促進心臟成纖維細胞中Fgf13的表達

在AngⅡ刺激下活化型Rac1表達上調（圖1A）。為探究激活的Rac1與Fgf13表達量之間的關系，對AFs分別轉染Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12腺病毒，并予以驗證病毒轉染效果（圖1B）。Western Blot結果顯示Ad-Vector組與Ad-Rac1組無統計學差異，而與Ad-Vector組比較Ad-Rac1-V12組Fgf13蛋白表達顯著上升，且纖維化相關蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達水平升高（圖1C、D）。該結果提示持續活化的Rac1促進AFs中Fgf13的表達。

2.2 阻斷Rac1減輕AngⅡ對Fgf13的誘導作用

圖1 AngⅡ激活Rac1導致心臟成纖維細胞Fgf13的表達上調A：Pull-down實驗驗證在AngⅡ刺激下活化型小G蛋白Rac1表達變化；B：AFs轉染空載腺病毒、Rac1腺病毒、Rac1-V12腺病毒48h后，Western Blot法檢測外源性Rac1的表達量；C、D：AFs轉染腺病毒48h后，Western Blot法檢測Ad-Vector、Ad-Rac1、Ad-Rac1-V12三組、CollagenⅠ、α-SMA、Fgf13的表達量差異。Ad-Rac1-V12組與Ad-Vector組比較，＊P ＜ 0.05，＊＊P ＜ 0.01。Mean±SEM，n=3

為進一步探究Ang-Ⅱ激活的Rac1與Fgf13之間的關系，使用Ang-Ⅱ刺激AFs，并加入Rac1特異性抑制劑NSC23766[18]（美國Sigma-Aldrich公司），檢測Fgf13表達變化。結果發現與空白對照組比較，Ang-Ⅱ刺激組Fgf13表達量上調，而予以Ang-Ⅱ刺激同時加入Rac1特異性抑制劑NSC23766組，Fgf13表達量降低（圖2A、B）。提示Rac1可能調控Fgf13的表達。

圖2 阻斷Rac1減輕AngⅡ對Fgf13的誘導作用A、B：Ang-Ⅱ刺激下與NSC23766抑制Rac1，分別對Fgf13表達量的影響。與Saline相比較，＊＊＊P＜0.001；與Ang-Ⅱ組相比較，#P＜0.05。Mean±SEM，n=3

2.3 下調Fgf13減輕活化型Rac1介導的AFs中纖維化相關蛋白的表達

為探究Fgf13在活化型Rac1介導AFs纖維化相關蛋白表達中的作用，采用小干擾技術抑制Fgf13的表達。小干擾序列如1.2.2中所述。Western Blot免疫印跡結果表明；加入小干擾RNA后Fgf13表達量降低，纖維化相關蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達量降低（圖3A、B），提示下調Fgf13減輕纖維化相關蛋白表達。圖3C、D結果顯示與Ad-Vector組 比 較，Ad-Rac1-V12組 的 CollagenⅠ、α-SMA表達顯著增高。而與Ad-Rac1-V12組比較，Rac1-V12+si-Fgf13組的CollagenⅠ、α-SMA表達降低，表明下調Fgf13可減輕活化的Rac1導致的纖維化相關蛋白的表達。

圖3 下調Fgf13減輕活化型Rac1介導的纖維化相關蛋白的表達A、B：小干擾序列下調AFs中Fgf13的表達。Western Blot檢測兩組相關纖維化相關蛋白的表達，＊P ＜0.05、＊＊P ＜0.01；C、D：AFs分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組，Fgf13的表達量變化，與 Ad-Vector組比較，＊P＜0.05、＊＊P＜0.01；與Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組比較，#P＜0.05，Mean±SEM，n=3

2.4 下調Fgf13減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用

為探究Fgf13在活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用，我們進行了CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs增殖和遷移能力，將AFs分為三組：Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組，結果顯示：與Ad-Vector組比較，Ad-Rac1-V12組AFs的增殖、遷移作用顯著增強，而下調Fgf13后作用明顯減輕（圖4A、B）。表明下調Fgf13可以減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用。

3 討論

Rac1是小三磷酸鳥苷酶結合蛋白，屬于Ras超家族中Rho亞家族的成員，它參與細胞信號轉導、基因轉錄調控等多種生理過程，從而影響細胞運動與增殖能力[19-20]，正常情況下Rac1的活性很低，而AngⅡ作為RAS系統的主要效應分子，可以激活Rac1，促進活化型Rac1的表達[21]，并通過激活NADPH氧化酶的途徑進而促進心房纖維化[6]。Rac1-V12是一種具有持久活性的Rac1人工突變體，在小鼠體內超表達會導致心肌肥厚[22]。其在心房纖維化方面的作用尚未闡明。

圖4 下調Fgf13減輕活化型Rac1對AFs的促增殖、遷移作用A：CCK-8實驗檢測Ad-Vector組、Ad-Rac1-V12組及Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13三組AFs的增殖能力，＊＊P＜0.01；B：細胞劃痕實驗檢測三組遷移能力的差異，與Ad-Vector組比較，＊＊P＜0.01；與 Ad-Rac1-V12+Si-Fgf13組比較，##P＜0.01，Mean±SEM，n=3

Fgf13是成纖維細胞生長因子（Fgf）家族成員，參與電壓門控Na+通道的調節[12]，研究表明，敲除Fgf13可以減輕壓力負荷介導的心臟肥厚[17]。目前Fgf13在纖維化方面還未研究，為探究Fgf13在心肌纖維化過程的作用，以及與Rac1的關系，我們進行了體外實驗，將Ad-Rac1和Ad-Rac1-V12轉染原代AFs。相較與Ad-Rac1組，Ad-Rac1-V12組纖維化相關蛋白CollagenⅠ、α-SMA表達水平升高，且Fgf13表達顯著上調，提示Fgf13可能與活化的Rac1促進纖維化機制相關。為進一步研究二者的關系，通過AngⅡ刺激AFs促進Rac1活化，發現Fgf13表達量升高。AngⅡ刺激的同時使用NSC23766抑制Rac1活性，Fgf13表達下調，表明Fgf13可能受Rac1的調控。為進一步探究Fgf13的作用機制，通過體外實驗轉染小干擾RNA下調Fgf13，發現與NC組比較，Si-Fgf13組纖維化相關蛋白表達下降，提示下調Fgf13可以減輕心肌纖維化。為了研究Fgf13在活化型Rac1促纖維化機制中的作用，我們在體外實驗轉染Rac1-V12病毒的同時加入小干擾RNA下調Fgf13，結果顯示與超表達Rac1-V12組比較，Rac1-V12+Si-Fgf13組CollagenⅠ、α-SMA表達降低。鑒于心臟成纖維細胞的增殖和遷移也是心肌纖維化的重要特征[23]，我們進行了CCK-8和細胞劃痕實驗檢測AFs的增殖、遷移能力，結果發現與超表達Rac1-V12組比較，Rac1-V12+Si-Fgf13組增殖、遷移能力明顯下降，表明下調Fgf13可減輕活化型Rac1引起的心肌纖維化。

綜上所述，本研究闡述了AngⅡ促進心臟成纖維細胞增殖遷移的新機制：通過激活小G蛋白Rac1介導的Fgf13上調進而促進心臟成纖維細胞纖維化相關蛋白的表達。而對Fgf13下游調控機制還尚不明確，在后續研究中，我們將在整體動物水平及分子水平進一步明確Fgf13對心肌纖維化的調控機制，可能對心房纖維化的研究提供新思路。