脾胃虛寒型胃潰瘍病證結合大鼠實驗模型的建立及評價研究?

宋厚盼，曾梅艷，陳小娟，陳新怡，楊 燾，朱曉彤，李 亮，蔡 雄，喻 嶸，彭清華

(1. 湖南中醫藥大學中醫診斷學湖南省重點實驗室，長沙 410208； 2. 湖南中醫藥大學 中醫學院，長沙 410208； 3. 湖南中醫藥大學醫學院，長沙 410208)

胃潰瘍(gastric ulcer, GU)是消化系統的一種常見病、多發病，其典型的臨床表現為慢性、周期性、節律性的中上腹疼痛，常伴飽脹噯氣、泛酸、惡心、嘔吐等癥狀[1]。隨著現代社會生活節奏加快、工作及外界壓力增加、不良生活飲食習慣等都使GU的發病(復發)率呈逐年上升趨勢，嚴重影響人們的身心健康和工作生活狀態[2]。GU屬于中醫學“胃脘痛”“痞滿”“嘈雜”等范疇。從病因學角度分析，本病多由飲食不節、情志內傷、外邪犯胃、素體脾虛而致，臨床常見證型包括脾胃虛寒、胃陰不足、肝胃不和、肝胃郁熱、胃絡瘀血等。中醫病機理論認為，脾胃虛寒是GU起病和復發的病理基礎，脾胃虛寒始終貫穿于GU的病理過程之中[3]。因此，建立脾胃虛寒型GU病證結合實驗模型，對于GU疾病的基礎和臨床研究具有重要意義。

針對當前GU動物模型構建方法混雜，模型評價指標體系不統一，特異性、客觀性較差，本研究擬建立符合西醫疾病發病特點和中醫病因學發病特征的脾胃虛寒型GU病證結合大鼠模型。故采用反證方劑進行驗證，從癥狀與體征、組織、細胞、分子等多個層面對模型進行評價，以期為人類GU的臨床研究提供可靠、穩定、可重復的實驗動物模型，為臨床推廣應用中醫藥治療和預防GU復發提供科學依據。

1 材料

1.1 實驗動物

雄性SPF級SD大鼠，體質量(180±20)g，購于湖南斯萊克景達實驗動物有限公司(許可證號SCXK(湘)2016-0002)。正式實驗前先適應性喂養7 d，期間自由攝食與飲水，飼養溫度18℃～23℃，相對濕度45%～55%，光暗周期12 h。

1.2 藥品與試劑

黃芪建中湯(HQJZT)組方藥物黃芪、桂枝、白芍、甘草、大棗均購于湖南中醫藥大學第一附屬醫院，生姜、飴糖在農貿市場購置；阿司匹林(批號85599356)購于拜耳醫藥保健有限公司；PBS磷酸鹽緩沖液(PH 7.2-7.4，批號1016K022)購于北京索萊寶科技有限公司；丙二醛(MDA)測定試劑盒(批號20180629)、一氧化氮(NO)測定試劑盒(批號20180702)購于南京建成生物工程研究所；前列腺素E(PGE)試劑盒(批號201807)購于上海紀寧生物科技有限公司；TLR-2一抗(批號AH04173651)、MyD88一抗(批號AG07205376)、山羊抗兔二抗(批號AG11091289)均購于北京博奧森生物技術有限公司；DAB顯色試劑盒(批號ZLI-9018)、伊紅染液(批號150109)均購于北京中杉金橋生物技術有限公司；蘇木精(批號P4163)購于山東西亞化學工業有限公司。

1.3 主要儀器

RE-2000B旋轉蒸發儀，鞏義予華儀器設備有限公司；KD-BM II電腦生物組織包埋機，浙江省金華市科迪儀器設備有限公司；CM1900冷凍切片機，德國LEICA公司；YD-A生物組織攤片機，浙江省金華市益迪醫療設備有限公司；Moticam Pro 205 A三目生物顯微鏡，麥克奧迪(廈門)醫療診斷系統有限公司； Centrifuge 5810R高速冷凍離心機，德國Eppendorf公司；SmartSpecTMplus核酸蛋白測定儀，美國BIO-RAD公司；Cytation imaging reader，美國BioTek公司；UV-1750紫外可見光光度計，日本島津公司。

2 方法

2.1 藥物制備

黃芪建中湯組成：黃芪5 g，桂枝9 g，甘草6 g，大棗4枚，白芍18 g，生姜9 g，膠飴30 g[4]。按組方比例混合藥材飲片(膠飴除外)，蒸餾水浸泡1 h(料液體積比1∶8)，煎煮2次，每次40 min，紗布過濾，合并2次濾液后兌入膠飴，文火加熱溶化，減壓濃縮。按人與大鼠體表面積換算給藥劑量，以1 mL藥液/100 g體質量灌胃。

2.2 脾胃虛寒型GU大鼠模型的建立

36只SD大鼠按隨機數字表法分為正常組、模型組、HQJZT組(方藥反證組)3組。第1天起大鼠自由飲食飲水，模型組和HQJZT組給予1 g/mL番瀉葉水煎劑灌胃，每日定時將模型組、HQJZT組大鼠放入裝滿常溫自來水的水槽中游泳，直至大鼠四肢劃動無力，頭部沒入水中立即撈起，連續造模7 d，由此建立脾胃虛寒證模型。第8天開始，模型組大鼠給予無水乙醇1 mL/200 g體質量灌胃，1 h后再給予200 mg/kg劑量阿司匹林灌胃，連續給藥5 d，由此建立GU模型。HQJZT組則在模型組基礎上提前2 h預防性給予9.27 g/kg的HQJZT水煎劑，正常大鼠全程僅給予等量蒸餾水灌胃。末次給藥后大鼠禁食禁水12 h，麻醉大鼠腹主動脈采血分離血清。取出胃沿胃大彎剪開，清洗胃內容物，拍照記錄潰瘍情況。

2.3 一般癥狀與體征

觀測各組大鼠的精神狀態、整體活動情況、食欲狀態、毛發光澤、糞便性狀，對舌象、鼻唇、耳廓、爪趾進行重點細致觀察。隔天測定1次大鼠的體質量、進食量、飲水量和肛溫。

2.4 胃黏膜潰瘍指數(ulcer index, UI)測定

參照Guth標準[5]計算胃黏膜損傷積分：正常計0分，病灶長度≤ 1 mm計1分，1 mm <病灶長度≤ 2 mm計2分，2 mm <病灶長度≤ 3 mm計3分，3 mm <病灶長度≤ 4 mm計4分。病灶長度> 4 mm時分段計分，若病灶寬度> 2 mm則分數乘以2。最后以胃黏膜病灶分數總值的均值作為胃黏膜UI。潰瘍愈合率=[(模型組UI-藥物組UI)/模型組UI]×100%。

2.5 胃黏膜組織形態學觀察

摘取大鼠全胃，剪除胃底部分，用生理鹽水潤洗后以4%多聚甲醛固定，在胃竇至胃體部位取1×1 cm大小的組織，采用乙醇梯度脫水，常規石蠟包埋切片，蘇木精-伊紅(hematoxylin and eosin, HE)染色，中性樹膠封片后于光學顯微鏡下進行組織形態學觀察。

2.6 NO、MDA、PGE檢測

采用大鼠NO測定試劑盒、MDA測定試劑盒、PGE ELISA試劑盒，按照操作說明書步驟進行實驗，使用BioTek cytation5酶標儀檢測PGE和NO含量，使用島津UV-1750紫外可見光光度計測定MDA含量。PGE在波長450 nm處測定吸光度，作標準曲線方程，根據標準曲線的線性回歸方程計算樣品中PGE含量。NO和MDA的檢測波長分別為550 nm和532 nm。

2.7 免疫組化檢測TLR-2、MyD88表達

取胃竇至胃體黏膜損傷部位1 cm×1 cm大小的組織，以4℃生理鹽水清洗，4%多聚甲醛固定、脫水、石蠟包埋。將胃黏膜組織石蠟切片脫蠟、水化，每張切片滴加70 μL 3% H2O2室溫封閉，修復抗原，以5%胎牛血清封閉非特異性抗原。分別以TLR-2一抗(1∶100)、MyD88一抗(1∶100)4℃孵育過夜，滴加反應增強液，室溫反應20 min，PBS沖洗后以Goat anti-rabbit二抗(1∶2000)室溫孵育2 h。DAB溶液顯色，蘇木素復染，鹽酸乙醇分色，二甲苯透明，中性樹膠封片。每張切片在顯微鏡下拍攝4個高倍視野，采用Image Pro Plus圖像分析軟件測定TLR-2、MyD88蛋白表達的光密度(IOD)值。

2.8 統計學方法

3 結果

3.1 一般癥狀與體征

正常大鼠精神狀態良好，動作敏捷，活動自如，體肌健壯，背毛光亮密澤，大便正常；模型大鼠精神萎頓，動作遲緩無力，倦怠扎堆，瞇眼，體肌瘦削，體質量減輕，背毛疏散無澤甚至豎立發黃，大便溏泄、肛門污穢；給予HQJZT后大鼠精神狀態好轉，活動自如，反應靈敏，背毛柔順亮澤，大便恢復正常。

3.2 大鼠局部外觀改變(舌象、鼻唇、耳廓、爪趾)

圖1示，正常大鼠舌質紅活明潤，舌苔薄白，鼻唇淡紅微濕潤，耳廓紅白相間，脈絡清晰，爪趾暗紅，抓爬有力。模型大鼠舌質青紫，晦黯無光，鼻唇紫暗，耳廓淡白，脈絡收縮，爪趾不收，活動無力。給予HQJZT后大鼠舌象、鼻唇、耳廓、爪趾的色澤和形態均有明顯改善，與正常大鼠表現相似。

圖1 各組大鼠局部外觀改變示意圖

3.3 大鼠體質量、進食量、飲水量、肛溫變化

圖2示，模型大鼠在造模第7天起體質量、進食量均明顯下降，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。給予HQJZT后，大鼠體質量保持穩定增長，進食量明顯增加，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.05)(圖2A、2B)。造模第9天起模型大鼠飲水量呈現減少趨勢，給予HQJZT后大鼠飲水量略有增加(圖2C)。圖2D結果表明，造模第9天起，模型大鼠肛溫顯著下降，與正常組比較差異有統計學意義(P<0.05)。給予HQJZT治療后，肛溫顯著高于模型大鼠(P<0.05)。

注：與正常組比較：*P<0.05；與模型組比較：#P<0.05圖2 造模過程大鼠體質量(A)、進食量(B)、飲水量(C)、肛溫(D)變化比較示意圖

3.4 胃黏膜UI與潰瘍愈合率

圖3表1示，正常大鼠胃黏膜光整完好，模型大鼠胃黏膜可見明顯出血點或出血條帶，UI顯著高于正常組，差異有統計學意義(P<0.01)；給予HQJZT治療后UI明顯降低，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)，潰瘍愈合率為78.05%。

注：箭頭表示潰瘍部位圖3 各組大鼠胃黏膜損傷(潰瘍)示意圖

注：“*”顯示胃黏膜上皮脫落并形成潰瘍；箭頭顯示炎性細胞浸潤及黏膜下層增厚圖4 各組大鼠胃黏膜損傷病理分析比較(HE染色 ×100和200)

表1 各組大鼠UI和潰瘍愈合率比較

3.5 胃黏膜病理組織切片觀察

圖4示，正常大鼠胃組織層次分明，結構完整，上皮細胞排列整齊，未見損傷、脫落，黏膜表面胃小凹清晰可見，固有腺體排列規則緊密，未見明顯充血及炎細胞浸潤。模型大鼠胃黏膜出現明顯損傷，大量上皮細胞變性、糜爛、脫落；胃小凹結構破壞，腺體結構紊亂；黏膜肌層可見不同程度的水腫及炎性細胞浸潤，黏膜下層增厚。給予HQJZT后大鼠胃黏膜恢復完整，未見上皮脫落和腺體損傷，少見炎性細胞浸潤。

3.6 胃黏膜PGE、MDA、NO含量改變

表2示，與正常組比較，模型組PGE、NO含量顯著下降(均P<0.01)；給予HQJZT后，PGE、NO含量明顯增加，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。模型大鼠胃黏膜MDA含量顯著高于正常組(P<0.01)，給予HQJZT后MDA含量明顯減少，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

3.7 胃黏膜TLR-2及MyD88蛋白表達

圖5表2示，模型大鼠胃黏膜TLR-2及MyD88蛋白表達量均顯著高于正常大鼠(P<0.01)。給予HQJZT后TLR-2及MyD88蛋白表達均顯著下調，與模型組比較差異有統計學意義(P<0.01)。

注：箭頭所示為TLR-2和MyD88陽性表達部位圖5 大鼠胃黏膜TLR-2及MyD88表達示意圖(免疫組化染色，× 200)

4 討論

動物模型是現代醫學研究的重要實驗方法與手段。隨著中醫藥研究發展的需求，各種類型的動物模型已被廣泛應用于中醫藥領域，在中藥復方藥效機制研究、中藥新藥開發等方面均發揮著舉足輕重的作用。病證結合動物模型是指在中醫藥理論指導下，在結合現代醫學理論與實驗動物科學知識基礎上，通過臨床調查研究，選擇有密切聯系的疾病和證候，分別(或同時)采用現代醫學病因復制疾病動物模型和采用傳統中醫學病因復制證候動物模型，使該模型同時具備疾病和證候的特征[8]。

中醫病機理論認為，脾胃虛寒是GU發生的根本內因，脾胃虛寒始終貫穿于GU的病理過程中。有學者對3422例GU辨證治療的臨床研究文獻進行統計分析，發現脾胃虛寒和肝胃不和是本病最常見的證型[9]。《消化性潰瘍中醫診療專家共識意見(2017年)》[10]和《消化性潰瘍中西醫結合診療共識意見(2017年)》[11]均建議，以HQJZT加減治療脾胃虛寒型GU。本研究采用“苦寒瀉下+勞倦過度”復合中醫病因造模法構建脾胃虛寒證候模型，采用“無水乙醇+阿司匹林”誘導GU模型，并從宏觀癥狀與體征、組織形態、細胞、分子層面，根據“有是證用是方”理論，引入反證方劑HQJZT對所建模型進行客觀評價。

病證結合動物模型建立成功與否，其評判標準如何是一個極具價值的關鍵問題。此前有研究者采用飲食失節與改良Okabe法制備脾胃虛寒型GU動物模型，以潰瘍發生率、耐寒性(游泳時間)、潰瘍面積及血清胃泌素(GAS)含量變化作為模型評價指標[12]；另有研究者采用隔日喂飼豬油和白菜聯合醋酸涂抹胃壁造模法構建脾胃虛寒型GU動物模型，以UI、血清及胃黏膜中超氧化物歧化酶(SOD)、MDA水平作為模型評價指標[13]。

本研究以中醫學病因病機、藏象理論為指導，以人體規范化證候為基礎，首先從整體癥狀和體征對模型進行評價。經過中醫病因學造模和西醫病因學造模，模型大鼠出現明顯的癥狀和體征病理改變(圖1)。給予HQJZT治療后，大鼠整體狀態好轉，這些結果從宏觀癥狀體征層面和方藥反證角度初步揭示了脾胃虛寒證候模型構建成功。GU發病機制的現代理念認為，胃黏膜屏障健康就不會形成潰瘍，潰瘍的發生是黏膜屏障被破壞的結果[14]。肉眼觀察結果顯示，正常大鼠胃黏膜光整完好，模型大鼠胃黏膜充血、水腫，可見明顯出血點或條帶(圖3)。給予HQJZT后黏膜損傷明顯好轉，UI顯著降低。胃黏膜病理組織切片觀察結果亦表明，黃芪建中湯可修復模型大鼠損傷的黏膜組織，使炎性細胞數量明顯減少(圖4)。以上結果從組織形態學層面和方藥反證角度提示，本研究所構建的實驗模型為脾胃虛寒型GU病證結合模型。

PGE是一種生物效應很強的內源性細胞因子，它可抑制胃酸分泌，增加黏膜血流量，刺激胃黏液和碳酸氫鹽分泌，保護胃黏膜屏障[15]。MDA是氧自由基引起脂質過氧化反應的終產物，其含量的高低可反映機體脂質過氧化程度及潰瘍損傷的程度[16]。NO是一種內源性的血管舒張因子，可擴張胃黏膜血管，增加黏膜血流量，在促進潰瘍修復過程中發揮重要作用[17]。本文(表2)結果表明，給予HQJZT治療可使模型大鼠PGE、NO含量明顯提高，MDA含量顯著減少。以上結果從細胞因子層面和方藥反證角度提示，本研究所構建的模型為脾胃虛寒型GU病證結合實驗模型。

TLR-2為廣泛表達于胃腸黏膜組織的天然免疫受體，髓樣分化因子88(MyD88)是TLR-2胞內結構域的重要接頭蛋白，參與TLR-2介導的信號傳導[18]。眾多研究表明，GU發病過程中，TLR-2/MyD88信號可被立即激活，阻斷TLR-2/MyD88信號則可促進黏膜損傷修復，加速潰瘍愈合[6-7]。本文研究結果表明，模型大鼠胃黏膜TLR-2及MyD88蛋白表達顯著增加，給予HQJZT后TLR-2及MyD88蛋白表達顯著降低(圖5表2)。以上結果從分子層面和方藥反證的角度進一步提示，本研究所建立的模型為脾胃虛寒型GU病證結合實驗模型。

基于本文所有實驗結果，脾胃虛寒型GU病證結合大鼠模型成功的標準，可概況為大鼠的總體活動狀態、局部外觀改變(舌象、鼻唇、耳廓、爪趾)、一般體征(體質量、進食量、飲水量、肛溫)均符合脾胃虛寒證候的特征；肉眼觀察胃黏膜可見明顯的潰瘍損傷，HE染色檢測胃黏膜呈現明顯病理改變；胃黏膜組織保護因子(PGE、NO)含量降低，攻擊因子(MDA)含量增加；抑制胃黏膜天然免疫的信號分子TLR-2/MyD88表達顯著上調。綜上所述，本研究建立了一種可靠、穩定、重現性好的脾胃虛寒型GU大鼠病證結合實驗模型。該模型的成功構建可望為潰瘍病的中西醫結合診療提供參考，為中醫藥在臨床治療潰瘍性疾病的推廣應用提供科學依據，亦有助于中醫藥抗潰瘍作用機制及新藥開發的研究。