基于Calpain-ERK信號通路研究Calpeptin對雌激素誘導人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及干性標志物表達的影響

張艷 王旭東 金愛 何艷 詹云惠 沈敬堃 董宇華 宛蕾

摘 要 目的：研究鈣激活中性蛋白酶（Calpain）抑制劑Calpeptin對雌二醇（E2）誘導人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及干性標志物表達的影響，并探討其作用機制。方法：以人乳腺上皮細胞MCF-10A為研究對象，采用E2誘導制備轉化細胞模型。將細胞分為對照組[0.1%二甲基亞砜（DMSO）]、E2轉化組（50 nmol/L）、E2轉化+Calpeptin組（50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin），以相應含藥培養基連續培養15代。然后采用MTT法檢測細胞的增殖率（24、48 h），采用平板克隆試驗檢測細胞的克隆形成率，采用懸浮成球試驗檢測細胞的成球數;采用實時熒光定量-聚合酶鏈式反應法檢測細胞中干性標志物（CD44、Nanog、OCT4）和細胞外信號調節激酶（ERK）mRNA表達水平，并采用Western blotting法檢測細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和磷酸化ERK（p-ERK）蛋白表達水平。另取E2轉化細胞分為對照組（0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制劑）組（10 μmol/L），按上述方法測定細胞的克隆形成率、成球數以及細胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達水平，以驗證ERK表達抑制與轉化細胞生物學行為及干性標志物表達之間的關系。結果：與對照組比較，E2轉化組細胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均顯著升高（P<0.01），細胞成球數均顯著增加（P<0.01），細胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK mRNA表達水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達水平均顯著升高（P<0.01）。與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞的增殖率（24、48 h）、克隆形成率均顯著降低（P<0.01），細胞成球數顯著減少（P<0.05），細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表達水平及CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。加入ERK抑制劑U0126后，E2轉化細胞的克隆形成率、成球數以及細胞中p-ERK、CD44、Nanog、OCT4蛋白表達水平均顯著增加或升高（P<0.05或P<0.01）。結論：Calpeptin可抑制E2誘導的人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及干性標志物表達，其機制可能與抑制Calpain-ERK信號通路的激活有關。

關鍵詞 Calpeptin;雌二醇;人乳腺上皮細胞MCF-10A;細胞轉化;干性標志物;細胞外信號調節激酶;機制

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the effects of Calpeptin inhibitor Calpeptin on the transformation and stemness markers expression induced by estradiol （E2）， and to investigate its mechanism. METHODS： Taking human mammary epithelial cells MCF-10A as research object， transformed cells were induced by E2 treatment. Cells were divided into control group（0.1%DMSO）， E2-transformed group （50 nmol/L）， E2-transformed+Calpeptin group （50 nmol/L E2+1 μmol/L Calpeptin）， then continuously treated with corresponding drug-containing culture medium for 15 generations. Then， MTT assay was used to determine the proliferation rate of cells （24，48 h）; plate colony test was used to detect the Clone formation rate of cells; the number of sphere-forming cells was measured by suspension spheroidization test;mRNA expressions of stemness marker （CD44， Nanog， OCT4） and extracellular sigal-regulated kinase （ERK） were detected by RT-qPCR，and protein expressions of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and p-ERK were detected by Western blotting assay. Another E2-transformed cells were divided into control group （0.1%DMSO） and U0126 （ERK inhibitor） group （10 μmol/L）. Clone formation rate， the number of sphere-forming， protein expressions of CD44， Nanog， OCT4，ERK and p-ERK were determined with above methods， and to validate the relationship of ERK inhibition with transformed cell behavior and the expression of stemness markers. RESULTS：Compared with control group， proliferation rate and clone formation rate of E2 transformed group were increased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was increased significantly （P<0.01）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4，ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK in cells were increased significantly （P<0.01）. Compared with E2-transformed group， proliferation rate （24， 48 h） and clone formation rate of E2-transformed+Calpeptin group were decreased significantly （P<0.01）， and the number of sphere-forming was decreased significantly （P<0.05）; mRNA expression levels of CD44， Nanog， OCT4 ， ERK and protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4， p-ERK in cells were decreased significantly （P<0.05 or P<0.01）. After treated with ERK inhibitor U0126， clone formation rate of E2-transformed cells， the number of sphere-forming， protein expression levels of CD44， Nanog， OCT4 and p-ERK were increased significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Calpeptin can inhibit the transformation and the expression of stemness markers of human mammary epithelial cells MCF-10A， and the mechanism of it may be associated with inhibiting the activation of Calpain-ERK signaling pathway.

KEYWORDS? ?Calpeptin; Estradiol; Human mammary epithelial cells MCF-10A; Cell transformation; Stemness marker; Extracellular sigal-regulated kinase; Mechanism

雌二醇（E2）是誘導乳腺癌發生的主要風險因素[1]，其可通過激活雌激素受體（ER）或代謝產生有毒代謝產物，從而誘導乳腺上皮細胞轉化以及癌變發生[2-3]。相關研究顯示，乳腺腫瘤干細胞（BCSCs）在乳腺癌的發生、維持、轉移、治療抵抗和復發中起著重要作用，而E2與BCSCs的產生密切相關[4]。人乳腺上皮細胞MCF-10A是一種非致瘤性乳腺上皮細胞，正常情況下其呈不規則多邊形貼壁生長，且增殖緩慢;但經E2長期誘導后，MCF-10A細胞將失去上皮細胞相關特性，胞體變大，呈長梭形貼壁生長，增殖能力增強，且具有一定的間質特征[5]。近期有研究發現，E2能誘導人乳腺上皮細胞MCF-10A的自我更新、多潛能分化等干性特征增強，促進該細胞向BCSCs轉化[6]。

鈣激活中性蛋白酶（Calcium-activated neutral protease，縮寫為“Calpain”）是一種Ca2+依賴型半胱氨酸蛋白酶，主要成員有Calpain-1和Calpain-2，可參與調控乳腺癌細胞的多種惡性生物學行為[7-8]。Calpeptin是一種具有細胞穿透性的Calpain抑制劑，據相關研究報道，Calpeptin可通過抑制ER陽性乳腺癌細胞MCF-7中Calpain的活性，從而抑制細胞的遷移和侵襲[9]。本課題組前期研究發現，在E2誘導人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化的過程中，通常伴隨著Calpain活性的增強[10]。而Calpain活性增強在癌癥的發生發展中具有重要作用，其參與介導了上皮細胞轉化以及癌細胞的遷移、增殖[10-12]。但有關Calpain是否介導了E2誘導的乳腺上皮細胞MCF-10A干性特征增強，尚未見文獻報道。另有研究顯示，細胞外信號調節激酶（ERK）信號通路的激活與細胞的惡性轉化密切相關[13]。但Calpeptin是否能通過ERK通路干預乳腺上皮細胞MCF-10A轉化以及干性特征增強，也同樣尚未見文獻報道。鑒于此，本研究旨在通過探討Calpain抑制劑Calpeptin對E2誘導乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及干性標志物（CD44、OCT4、Nanog）表達的影響，并通過探究Calpain-ERK信號通路在其中的介導作用，為闡明Calpeptin抑制E2誘導乳腺癌發生的作用機制提供參考。

1 材料

1.1 儀器

ND2000型超微量紫外分光光度計、2001HY-6003型CO2細胞培養箱（美國Thermo Fisher Scientific公司）;HH-W21-Cr600型電熱恒溫水溫箱、DW-86L486型立式超低溫冰箱（青島海爾特種電器有限公司）;SW-CJ-2D型超凈工作臺（蘇州凈化設備有限公司）;FA2204N型電子天平（上海菁海儀器有限公司）;ZHWY-103D型恒溫培養振蕩器（上海智城分析儀器制造有限公司）;DYY-7C型電泳儀（北京市六一儀器廠）;Epoch型全波長酶標儀（美國Bio-Tek公司）;CKX41型倒置顯微鏡（日本Olympus公司）;TI-U-DS-RI2型倒置熒光顯微鏡（日本Nikon公司）;Centrifuge 5810R型高速冷凍離心機（德國Eppendorf公司）;TS-8型轉移脫色搖床、VORTEX-5型渦旋振蕩儀（海門市其林貝爾儀器制造有限公司）;Step One PlusTM型實時熒光定量-聚合酶鏈式反應（PCR）儀（美國Applied Biosystems公司）。

1.2 藥品與試劑

E2標準品（批號：WXBC5362V，純度：>98%）、Calpeptin（批號：C8999，純度：>98%）、氫化可的松標準品（批號：PHR1014，純度：100%）、霍亂毒素（批號：C8052，純度：95%）均購自美國Sigma公司;U0126（ERK抑制劑，美國Med Chem Express公司，批號：HY-12031，純度：>98%）;馬血清、0.25%胰蛋白酶、B-27添加物（50×）（美國Gibco公司，批號分別為：1893656、2046777、2046964）;表皮生長因子（ EGF，美國PeproTech公司，批號：0515AFC05）;成纖維細胞生長因子（FGFB，中國近岸蛋白質科技有限公司，批號：0331504）;重組人胰島素（上海翊圣生物科技有限公司，批號：11820131，含量：95%～105%）;磷酸鹽緩沖液（PBS）粉末、1%結晶紫染色液、5×蛋白質上樣緩沖液、十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）制備試劑盒、高效RIPA組織/快速裂解液、膜再生液（北京索萊寶科技有限公司，批號分別為：1022Q021、20180627、20190328、20191104、20190711、20190715）;青鏈霉素、DMEM/F12培養基（美國 Hyclone 公司，批號分別為：J150038、AE28870264）;二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度試劑盒（美國Thermo Fisher Scientific公司，批號：UD277257）;MTT試劑盒（北京博奧拓科技有限公司，批號：298-93-1）;Trizol試劑（美國Ambion Life Technologies公司，批號：149002）;反轉錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit、PCR反應試劑SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ（日本Takara公司，批號分別為：AK6301、AIG2363A）;CD44小鼠單克隆抗體、ERK兔多克隆抗體（美國Cell Signaling Technolog公司，批號分別為：3570S、4695S）;Nanog、OCT4兔單克隆抗體（美國Abcam公司，批號分別為：ab109250、ab109183）;磷酸化ERK（p-ERK）小鼠多克隆抗體（美國Santa Cruz公司，批號：SC-7383）;α-微管蛋白（α-tubulin）兔多克隆抗體、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）鼠單克隆抗體、辣根過氧化物酶標記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、辣根過氧化物酶標記的山羊抗鼠 IgG二抗（美國 Bioworld 公司，批號分別為：BS1699、MB001、BS13278、BS12478）;甲醇、二甲基亞砜（DMSO）、乙醇等均為分析純，水為雙蒸水。CD44、Nanog、OCT4、ERK和GAPDH引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.3 細胞

人乳腺上皮細胞MCF-10A由陸軍軍醫大學生物化學教研室饋贈。

2 方法

2.1 細胞培養

將人乳腺上皮細胞MCF-10A培養于DMEM/F12全培養基中（含有10%馬血清、10 ng/mL霍亂毒素、50? ? ng/mL氫化可的松、10 μg/mL胰島素、20 ng/mL EGF以及1%青鏈霉素，下同），在37 ℃、5%CO2的培養箱（后文條件相同）中進行培養，每48 h更換1次培養液。

2.2 細胞轉化試驗

將乳腺上皮細胞MCF-10A隨機分為對照組、E2轉化組（DMSO終體積分數為0.1%，下同）和E2轉化+Calpeptin組（DMSO終體積分數為0.1%，下同）。3組細胞分別以0.1%DMSO、E2（50 nmol/L）、E2（50 nmol/L）+Calpeptin（1 μmol/L）連續處理15代，每次傳代時均加入相應藥物處理，然后按照“2.1”項下條件進行培養，觀察細胞形態變化并拍照。細胞轉化標志：細胞形態發生變化（細胞胞體變大，胞內出現黑色顆粒，排列紊亂，呈長梭形貼壁生長，具有一定的間質細胞樣特性），生長加速，克隆形成能力增強[5]。

2.3 MTT試驗檢測細胞的增殖能力

取“2.2”項下3組對數生長期細胞，分別用0.25%胰蛋白酶消化后，以1 000 r/min離心5 min，用DMEM/F12全培養基重懸并調整各組細胞密度至4×104個/mL，然后接種于96孔板中，每孔200 μL，每組設置5個復孔。另外設置不加細胞只加培養基的調零孔。將培養板置于培養箱中培養至細胞貼壁，吸棄培養液，每孔中加入200 μL不含血清的DMEM/F12培養基，繼續培養24、48 h后，每孔中均避光加入5%MTT試液20 μL，混勻，培養3 h后，終止培養;棄去培養基，加入150 μL DMSO溶液，低速振蕩10 min。使用酶標儀于490 nm波長下測定各孔吸光度（OD），計算細胞增殖率。細胞增殖率（%）=（給藥組OD值-調零孔OD值）/（對照組OD值-調零孔OD值）×100%。試驗重復3次。

2.4 平板克隆試驗檢測細胞的克隆形成能力

取“2.2”項下3組對數生長期細胞，分別按400個/孔接種于6孔板中，每組設置3個復孔。每孔中加入4 mL DMEM/F12全培養基，于培養箱中培養14 d;棄去培養液，以PBS洗滌3次，加入4%多聚甲醛溶液固定30 min;以0.1%結晶紫染色30 min后，洗去染色液，常溫晾干。用相機拍照并觀察其克隆集落形成情況，使用Image J 1.8.0軟件對克隆集落進行計數，并計算其克隆形成率。克隆形成率（%）=（克隆集落形成數/接種細胞總數）×100%。試驗重復3次。

2.5 懸浮成球試驗檢測細胞的自我更新能力

取“2.2”項下3組處于對數生長期細胞，分別按? ? ? ?5 000個/孔接種于24孔超低黏附板中，每組設置3個復孔。每孔中加入2 mL懸浮成球試驗培養基（含5 μg/mL胰島素、2%B-27添加物、20 ng/mL EGF、20 ng/mL FGFB、1 μg/mL氫化可的松和1%青鏈霉素的DMEM/F12培養基），在培養箱中培養10 d后，于顯微鏡下拍照并對每組的成球情況進行計數。試驗重復3次。

2.6 實時熒光定量-PCR試驗檢測細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達情況

取“2.2”項下3組對數生長期細胞，分別按2×105個/孔接種于6孔板中，每組設置2個復孔。待細胞貼壁后，以DMEM/F12培養基（不含血清）于培養箱中培養48 h。按照Trizol說明書方法操作，分離提取細胞中的總RNA，用超微量分光光度計測定各組RNA濃度。使用PrimeScriptTM RT reagent Kit試劑盒并按說明書方法操作，將1 μg總RNA逆轉錄為cDNA，并以cDNA為模板進行PCR擴增。反應體系：cDNA模板2 μL，上、下游引物各0.8 μL，SYBR? Premix Ex TaqTM Ⅱ 10.4 μL、無酶水6 μL，總體系為20 μL。反應條件：95 ℃預變性30 s;95 ℃變性3 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，共40個循環。以GAPDH為內參，采用2-ΔΔct法計算CD44、Nanog、OCT4和ERK mRNA的表達水平（其中ct表示每個反應管內的熒光信號達到設定閾值時所經歷的循環次數）。試驗重復3次。引物序列及擴增產物長度見表1。

2.7 Western bloting試驗檢測細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白的表達情況

取“2.2”項下3組對數生長期細胞，分別按“2.6”項下方法進行細胞接種、培養，然后以RIPA蛋白裂解液提取總蛋白，再以BCA法進行蛋白定量后進行制樣。蛋白樣品在80 V電壓下電泳30 min后，調節電壓至120 V繼續電泳1 h;然后以電流300 mA轉膜[聚偏氟乙烯（PVDF）膜]1.5 h，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h;分別加入稀釋比例均為1 ∶ 1 000的CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK一抗和稀釋比例為1 ∶ 10 000的GAPDH一抗，4 ℃下孵育過夜;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min;加入相應二抗（稀釋比例均為1 ∶ 10 000），室溫下孵育1 h;以1×TBST溶液洗膜3次，每次10 min，再用ECL發光試劑盒顯色。以凝膠成像系統成像，并用Image J 1.8.0軟件分析，以目的蛋白條帶灰度值與內參GAPDH蛋白條帶灰度值的比值表示目的蛋白的表達水平。試驗重復3次。

2.8 U0126抑制ERK蛋白表達后對E2轉化細胞克隆形成能力、自我更新能力以及干性標志物表達的影響

取對數生長期的E2轉化細胞，隨機分為對照組（含0.1%DMSO）和U0126（ERK抑制劑）組（10 μmol/L）。分別按“2.4”項下方法檢測細胞的克隆形成能力，按“2.5”項下方法檢測細胞自我更新能力，按“2.7”項下方法檢測細胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表達情況（以α-tubulin為內參，稀釋比例為1 ∶ 10 000）。試驗均重復3次。

2.9 統計學方法

采用SPSS 11.5軟件對數據進行統計處理和分析。數據以x±s表示。多組間比較采用單因素方差分析，兩獨立樣本組間比較采用t檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

3 結果

3.1 Calpeptin對E2轉化細胞形態學特征的影響

細胞形態學觀察發現，與對照組比較，E2轉化組細胞形態發生了明顯變化，細胞呈長梭形貼壁生長，細胞體積變大，具有一定的間質細胞樣特征;E2轉化+Calpeptin組細胞形態與對照組接近。各組細胞形態學特征顯微圖見圖1。

3.2 Calpeptin對E2轉化細胞增殖能力的影響

培養24、48 h后，與對照組比較，E2轉化組細胞的增殖率均顯著升高（P<0.01）;與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞的增殖率均顯著降低（P<0.01）。各組細胞增殖率測定結果見表2。

3.3 Calpeptin對E2轉化細胞克隆形成能力的影響

與對照組比較，E2轉化組細胞的克隆形成率顯著升高（P<0.01）;與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞的克隆形成率顯著降低（P<0.01）。各組細胞克隆形成情況平板圖見圖2，克隆形成率測定結果見表3。

3.4 Calpeptin對E2轉化細胞自我更新能力的影響

與對照組比較，E2轉化組細胞的成球數顯著增加（P<0.01）;與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞的成球數顯著減少（P<0.05）。各組細胞成球情況顯微圖見圖3，成球數測定結果表4。

3.5 Calpeptin對E2轉化細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA表達的影響

與對照組比較，E2轉化組細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達水平均顯著升高（P<0.01）;與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK mRNA的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）。各組細胞中4種標志物mRNA表達水平測定結果見表5。

3.6 Calpeptin對E2轉化細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK和p-ERK蛋白表達的影響

與對照組比較，E2轉化組細胞中CD44、Nanog、OCT4和p-ERK蛋白的表達水平均顯著升高（P<0.01）;與E2轉化組比較，E2轉化+Calpeptin組細胞中CD44、Nanog、OCT4、p-ERK蛋白的表達水平均顯著降低（P<0.05或P<0.01）;3組細胞中ERK蛋白表達水平間比較，差異均無統計學意義（P>0.05）。各組細胞中CD44、Nanog、OCT4、ERK、p-ERK蛋白表達電泳圖見圖4，蛋白表達水平測定結果見表6。

3.7 ERK表達被抑制后對E2轉化細胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相關蛋白表達的影響

與對照組比較，U0126組中p-ERK蛋白表達水平顯著降低（P<0.05），表明ERK蛋白表達被抑制;細胞的克隆形成率顯著降低（P<0.01），成球數顯著減少（P<0.05），干性相關蛋白（CD44、Nanog、OCT4）的表達水平也顯著降低（P<0.05）。這提示抑制ERK表達后，E2轉化細胞的克隆形成能力、自我更新能力以及干性相關蛋白的表達均減弱。ERK抑制劑U0126作用下各組細胞中ERK、p-ERK蛋白和干性相關蛋白表達測定結果見圖5、表7，細胞克隆形成和細胞成球情況測定結果見圖6、表8。

4 討論

乳腺上皮細胞發生轉化是乳腺癌發生的必要過程。腫瘤干細胞是細胞內具有自我更新、多潛能分化和腫瘤特殊生物學行為的一類細胞亞群，與癌癥的發生發展密切相關[14]。近期有研究顯示，E2可以促進乳腺上皮細胞MCF-10A獲得干細胞特性[6]。CD44、Nanog和OCT4均是公認的癌癥干細胞標志物。據報道，CD44可通過與細胞外基質成分、生長因子和細胞因子相互作用來促進腫瘤的發生[15]。而Nanog和OCT4在多種癌癥干細胞中都呈異常高表達狀態，其高表達后能夠促進細胞的重新編程，從而調控腫瘤細胞增殖、自我更新和多能性分化等干細胞特征[16-17]。本研究采用E2連續培養乳腺上皮細胞MCF-10A 15代，發現E2處理后細胞出現了一定的間質細胞樣特征，細胞活力、克隆形成能力以及自我更新能力均顯著增強，這表明細胞在E2作用下發生了轉化。同時，E2轉化細胞中干性標志物CD44、Nanog、OCT4 mRNA及其蛋白的表達均顯著上調，這提示E2不僅可誘導細胞轉化，還可增強轉化細胞的干性特征。

Calpain的生物學活性與腫瘤的發生有關，其可通過修飾性剪切多種腫瘤抑制蛋白，促進上皮細胞的轉化[18-19]。Calpain抑制劑Calpeptin是一種具有細胞滲透性的特異性抑制劑。據相關文獻報道，Calpeptin在1～10 μmol/L濃度范圍內能顯著抑制E2誘導的人乳腺癌細胞MCF-7的增殖[20]。本課題組前期研究也發現，10? ? ? ? μmol/L Calpeptin能顯著抑制E2誘導的MCF-10A轉化細胞的增殖[21]。故在本次研究的預試驗中，筆者先是以1、5、10 μmol/L Calpeptin聯合E2連續處理細胞MCF-10A 15代。結果發現，在5、10 μmol/L Calpeptin的作用下細胞逐漸凋亡，只有在1 μmol/L濃度下細胞能夠正常生長，同時能顯著抑制E2誘導的細胞轉化。所以，在本次探討Calpeptin對E2誘導人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化和干性特征的影響機制研究中，筆者選擇1 μmol/L為干預濃度。結果發現，該濃度下Calpeptin 可抑制E2誘導乳腺上皮細胞MCF-10A的轉化和干性特征的增強，這提示Calpain可能參與介導了E2誘導的細胞轉化和干性特征增強。

當ERK信號通路被激活時，非活性ERK被磷酸化為活化形式的p-ERK，并由細胞質轉移至細胞核內，轉錄激活核內的轉錄因子，進而促進細胞增殖、分化以及癌癥發生[22]。有研究顯示，ERK信號通路的激活與乳腺癌[23-24]、肺癌[25-26]、甲狀腺癌[27]等癌癥細胞的增殖、遷移以及干細胞特性增強相關。本研究結果顯示，E2轉化組細胞可高表達ERK mRNA和p-ERK蛋白，但E2轉化+Calpeptin組細胞ERK mRNA和p-ERK蛋白的表達明顯下調，這提示Calpeptin抑制E2誘導的細胞轉化以及干性標志物表達的作用可能與抑制ERK信號通路的激活有關。為了驗證以上結論，筆者進一步以ERK特異性抑制劑U0126處理E2轉化細胞。結果發現，經U0126處理后，細胞的增殖能力和自我更新能力均顯著減弱，干性相關蛋白的表達也顯著下調，這進一步說明ERK信號通路可能參與介導了E2誘導乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及其干性增強。有文獻報道，E2可通過激活Calpain-ERK信號通路促進ER陽性乳腺癌細胞的增殖[28]。但本研究發現，Calpain抑制劑Calpeptin在抑制E2誘導細胞轉化的同時，能顯著下調E2誘導的p-ERK蛋白的表達。由此推測，細胞內可能存在Calpain-ERK的正反饋環路，后者在E2作用下被激活，促進Calpain活性增強，從而參與誘導細胞轉化及其干性增強;而當Calpain活性被抑制時，可能反饋性調節ERK的磷酸化作用，抑制了ERK的磷酸化，從而抑制細胞轉化以及干性增強。

綜上所述，Calpeptin能抑制E2誘導的人乳腺上皮細胞MCF-10A轉化及干性標志物的表達，其機制可能與抑制Calpain-ERK信號通路的激活有關，但其具體作用靶點和機制有待后續研究進一步確證。

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（收稿日期：2020-03-02 修回日期：2020-05-13）

（編輯：林 靜）