基于1H-NMR代謝組學技術比較熏硫和未熏硫白芷的化學成分差異及化學標志物篩選

董蕓 田玫瑰 唐榮偉 唐玲 趙程成 張藝 范剛

摘 要 目的：研究熏硫與未熏硫白芷藥材的整體化學成分差異，并篩選可用于兩者鑒別的化學標志物。方法：分別以硫熏和未硫熏的白芷藥材各16批為檢測樣品，以氘代甲醇-重水（1 ∶ 0.2，V/V）為提取溶劑，采用氫核磁共振（1H-NMR）代謝組學技術檢測兩種方法處理的白芷藥材中的初級和次級代謝產物。利用直觀分析、主成分分析（PCA）和t檢驗比較二者的化學成分差異，并確定化學標志物。結果：從兩種白芷藥材中同時檢測并鑒定出了包括香豆素類、氨基酸類、糖類在內的19種化學成分。直觀分析發現，兩種白芷藥材的化學成分輪廓相似，但香豆素類和糖類成分的1H-NMR信號強度有較大的差異;PCA分析結果顯示，所有樣品按不同處理方法分成兩類;t檢驗結果顯示，白芷熏硫后氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量均顯著降低（P<0.01或P<0.001），丙氨酸、亮氨酸含量均顯著升高（P<0.01或P<0.001），而其余13種成分含量差異無統計學意義（P>0.05）。結論：熏硫和未熏硫白芷藥材中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖、丙氨酸、亮氨酸6種化學成分存在明顯的差異，可作為化學標志物用于市場上熏硫白芷的鑒別。

關鍵詞 白芷;熏硫;氫核磁共振代謝組學;化學標志物;鑒別

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the differences in the overall chemical constituents of Angelicae dahuricae with and without sulphur-fumigation， and to select chemical markers that can be used for identification. METHODS： Each 16 batches of A. dahuricae with and without sulphur-fumigation were selected as samples. Deuterated methanol-deuterium oxide （1 ∶ 0.2， V/V） was used as extraction solvent， and 1H-NMR metabolomics was used to detect the primary and secondary metabolites in A. dahuricae. In addition， visual analysis， principal component analysis （PCA） and t-test were used to compare the component differences of A. dahuricae by two kinds of pretreatment methods. RESULTS： A total of 19 chemical constituents such as coumarins， amino acids and sugars were simultaneously detected and identified from two kinds of A. dahuricae. Visual analysis showed that the chemical profiles of the two kinds of A. dahuricae were similar， but their coumarins and carbohydrates were quite different in 1H-NMR signal intensity. PCA analysis showed that all samples could be divided into two categories according to different treatment methods. The results of t-test showed that the contents of oxypeucedanin， imperatorin， glucose and sucrose of A. dahuricae were decreased significantly after sulphur fumigation （P<0.01 or P<0.001）， while the contents of alanine and leucine were significantly increased （P<0.01 or P<0.001）. There was no statistical significance in the contents of other 13 kinds of components （P>0.05）. CONCLUSIONS： There are obvious differences in the 6 chemical compounds of oxypeucedanin， imperatorin， glucose， sucrose， alanine and leucine in A. dahuricae with and without sulphur-fumigation， which can be used as chemical markers for the identification of sulphur-fumigated A. dahuricae in the market.

KEYWORDS? ?Angelicae dahuricae; Sulphur-fumigation; 1H-NMR metabolomics; Chemical markers; Identification

白芷為常用中藥材，來源于傘形科植物白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.]或杭白芷[Angelica dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f. var. formosana （Boiss.） Shan et Yuan]的干燥根，其味辛，性溫，具有解表散寒、祛風止痛、宣通鼻竅、燥濕止帶、消腫排膿等功效，可用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞流涕、鼻淵、牙痛、帶下、瘡瘍腫痛等[1]。白芷藥材肉質根粗壯，富含淀粉，不易干燥，在潮濕環境下受損處易感染菜豆殼球孢真菌而發生腐爛[2]。另外，白芷藥材粉性強、香氣濃，在貯藏過程中極易發生蟲蛀[3]。目前，白芷新鮮藥材在產地大多使用硫磺熏蒸（簡稱“熏硫”）的方法進行加工處理，熏硫有增白、防蟲、防腐、防霉等作用，可使藥材易于保存和銷售。但現代研究表明，熏硫后白芷藥材的香豆素類有效成分發生了較大的變化[4-6]，影響了藥材的藥效，例如與未熏硫的白芷比較，熏硫白芷的抗炎、鎮痛作用減弱[7]。然而，除香豆素類成分以外，熏硫后白芷藥材中其他成分是否會發生變化還未見文獻報道。此外，白芷熏硫前后藥材的性狀并未發生明顯的變化，導致市場上白芷藥材是否熏硫難以從外觀上進行鑒別。因此，采用新的技術手段開展白芷熏硫后整體化學成分變化研究，并尋找新的客觀鑒別方法，對于該藥材的質量控制和臨床應用具有重要的意義。

目前，關于熏硫白芷的化學成分變化及質量評價研究，多是采用高效液相色譜法（HPLC）測定特征成分的含量或進行指紋圖譜分析[4-6]，但未見從初級與次級代謝產物角度開展其質量評價的報道。氫核磁共振（1H-NMR）代謝組學是近年來發展起來的新興分析技術，具有初級與次級代謝產物同時表征的優點[8-10]。這種整體性評價模式與中藥材治療疾病的整體觀、系統論相吻合，為中藥材內在質量的綜合評價提供了技術平臺。目前，1H-NMR代謝組學技術已廣泛應用于黃連、沙棘、烏梅等中藥材的品種鑒定和質量評價研究中[9-12]。本課題組前期建立了熏硫川白芷的1H-NMR主成分分析（PCA）鑒別預測模型[13]，但對白芷的整體化學成分沒有進行鑒定，也未發現可區別熏硫和未熏硫白芷的化學標志物。因此，本研究采用1H-NMR代謝組學技術，進一步從整體上鑒定分析白芷藥材的初級與次級代謝產物，并結合PCA分析和t檢驗方法，系統研究熏硫和未熏硫白芷的整體化學成分差異，以期篩選出可用于熏硫白芷鑒別的特征化學標志物，進而為白芷的質量控制提供科學依據。

1 材料

1.1 儀器

Varian Mercury Plus 400 MHz型NMR儀（美國Agilent公司）;BP221S型電子天平（北京賽多利斯科學儀器有限公司）;KQ-300B型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

本研究共收集了32批白芷藥材，包括16批未熏硫藥材及16批熏硫藥材，經成都中醫藥大學民族醫藥學院范剛副研究員鑒定均為傘形科植物白芷[A. dahurica （Fisch. ex Hoffm.） Benth. et Hook. f.]的干燥根;異歐前胡素對照品（批號：110827-201109，純度：98.5%）、補骨脂素對照品（批號：110739-200814，純度：98.6%）、東莨菪素對照品（批號：110768-200504，純度：98.5%）均購自中國食品藥品檢定研究院;歐前胡素、氧化前胡素、珊瑚菜素、Cnidilin、佛手柑內酯和異茴芹內酯均為本課題組從白芷藥材中分離得到，經HPLC法檢測其純度均大于98%;重水（D2O，純度：99.9%）、氘代甲醇（CD3OD，純度：99.8%）、3-（三甲基硅基）-2，2，3，3-四氘代丙酸鈉鹽（TSP）均購自美國Sigma-Aldrich公司;磷酸二氫鉀（成都市科龍化工試劑廠）。藥材來源信息見表1。

2 方法與結果

2.1 供試品溶液的制備

取干燥的白芷藥材粉末0.2 g，精密稱定，置于錐形瓶中，分別加入CD3OD溶液1.0 mL 和 D2O溶液0.2 mL（內含0.4 mg/mL TSP 和12.32 mg/mL的磷酸二氫鉀），搖勻，密封，超聲（功率：200 W，頻率：40 kHz，下同）提取30 min;取出，放冷，用0.45 ?m微孔濾膜濾過，取續濾液0.6 mL至標準的5 mm核磁管中，進行1H-NMR測定。

2.2 1H-NMR分析條件

以CD3OD為頻率內鎖，1H-NMR測定條件為：觀察頻率400.12 MHz，測定溫度（T）25 ℃，譜寬（sw）6 410.3 Hz，采樣時間（at）2.556 s，脈沖延遲時間（dl）2.0 s，采樣次數（nt）64，脈沖寬度（pw）6 ?s，采用標準的預飽和脈沖序列（Presat）壓制殘留的水峰信號。

2.3 數據處理及統計分析

將測得的1H-NMR自由感應衰減（FID）信號導入MestReNova 6.1.0軟件進行傅里葉轉換，并手動調整相位和基線，以TSP峰（0.0 ppm）為基準校正所有樣品的化學位移。對0.50～8.50 ppm范圍內的圖譜以0.04 ppm為單位進行分段積分（binning），并以總峰面積進行歸一化處理，然后以ASCII格式輸出數據，即得到各化學位移段與之相對應的信號峰面積值，并扣除甲醇溶劑的信號（3.26～3.34 ppm）及殘留水峰信號（4.66～5.02 ppm）。將最終獲得的數據矩陣，導入SIMCA 11.5軟件進行PCA分析。此外，采用GraphPad Prism 5.0軟件進行統計學分析，兩組樣品比較采用配對t檢驗，P<0.05表示差異有統計學意義。

2.4 方法學考察

2.4.1 儀器精密度考察 取同一批未熏硫白芷供試品溶液（批號：BZ-1），分別連續進行1H-NMR測定5次，按“2.3”項下數據處理方法處理圖譜，得到5組積分值數據，運用Excel 2007軟件計算5組數據之間的相關系數，結果分別為0.995、0.993、0.997、0.995和0.998，均大于0.99，表明儀器精密度良好。

2.4.2 方法重復性考察 取同一批未熏硫白芷藥材（批號：BZ-1）粉末5份，按“2.1”項下方法制得供試品溶液，再分別進行1H-NMR測定和數據處理，得到5組積分值數據，運用Excel 2007軟件計算5組數據之間的相關系數，分別為0.994、0.995、0.996、0.998、0.995，均在0.99以上，表明該方法具有較好的重復性。

2.5 白芷整體化學成分的1H-NMR檢測及鑒定

取一批未熏硫白芷藥材（批號：BZ-1）粉末適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項條件下進行1H-NMR測定。采用“加標準品定性”試驗進行9種次級代謝產物（氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、Cnidilin、珊瑚菜素、佛手柑內酯、異茴芹內酯、東莨菪素、補骨脂素）的1H-NMR信號歸屬，即在供試品溶液中分別加入各對照品2 mg，超聲2 min使溶解，再進行1H-NMR測定。通過MestReNova 6.1.0軟件比對加入對照品前后的1H-NMR圖譜差異，根據峰的變化確定信號歸屬。此外，通過比對SDBS光譜數據庫（http：//sdbs.db.aist.go.jp）及參考相關文獻[11，14]進行氨基酸、糖類等初級代謝產物的1H-NMR信號歸屬。結果，采用1H-NMR分析技術，從白芷藥材中共鑒定出19種化學成分（α-葡萄糖和β-葡萄糖計為1種）。白芷1H-NMR圖譜大致可以分為3個區域：高場區（3.1～0.0 ppm）主要包括有氧化前胡素、歐前胡素、異歐前胡素、Cnidilin、丁二酸、谷氨酰胺、谷氨酸、醋酸鹽、丙氨酸、亮氨酸、纈氨酸以及飽和脂肪酸和不飽和脂肪酸類成分等;中場區（5.5～3.1 ppm）主要有蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖等;低場區（9.5～5.5 ppm）主要有異茴芹內酯、東莨菪素、補骨脂素等。白芷藥材代表性的1H-NMR圖譜見圖1。

2.6 熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜比較

分別取同一批熏硫（批號：XLBZ-1）和未熏硫（批號：BZ-1）白芷藥材粉末各適量，按“2.1”項下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項條件下分別進行1H-NMR測定，得到熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜。通過直觀分析，發現熏硫和未熏硫白芷的整體化學成分輪廓相似，但二者有些成分的信號強度有較大的差異，如未熏硫白芷的蔗糖、α-葡萄糖、β-葡萄糖及一些未鑒定的糖類（3.3～4.1 ppm）的信號強度明顯高于熏硫白芷，而丙氨酸的信號強度弱于熏硫白芷。此外，通過放大1H-NMR圖譜的低場區（6.2～8.5 ppm），發現白芷熏硫后主要的香豆素類成分（如氧化前胡素、歐前胡素）的信號強度也有所不同，表明兩種白芷的化學成分含量有一定的差異。熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜見圖2（注：圖中化學成分編號同圖1）。

2.7 基于PCA分析的熏硫和未熏硫白芷差異比較

白芷含有的化學成分復雜，其1H-NMR圖譜可以提供大量的化學成分信息。PCA是最常用的無監督模式識別方法，其能簡化數據結構，將原始的多變量數據進行降維處理，有利于觀察不同樣本數據的分布特征[8]。分別取硫熏和未硫熏的樣品粉末各16批，按“2.1”項下方法制備供試品溶液后，在“2.2”項條件下分別進行1H-NMR測定，得到熏硫和未熏硫白芷的1H-NMR圖譜。將1H-NMR測定獲得的數據進行PCA分析，研究兩種處理方法的樣品是否存在差異，結果見圖3（圖中每個點代表1個樣品）。得分圖中，第一主成分（PC1）得分為97.6%，第二主成分（PC2）得分為1.1%。兩組樣品被明顯地分離，其中熏硫白芷樣品位于PCA得分圖的左邊，而未熏硫白芷樣品位于得分圖的右邊，這表明二者的整體化學成分存在一定的差異，也說明1H-NMR代謝組學結合PCA分析可用于熏硫白芷的鑒別。此外，從圖3也可以看出，熏硫白芷的組內差異大于未熏硫白芷，這可能是由于熏硫時間和硫磺用量不一致所引起的，也說明硫磺熏蒸工藝難以控制，會影響白芷藥材質量的穩定性和均一性。

2.8 鑒別熏硫白芷的特征化學標志物篩選

為了確定可用于熏硫和未熏硫白芷鑒別的化學標志物，筆者進一步觀察了19種化學成分在兩組樣品間的實際水平差異。1H-NMR信號強度直接與化合物的摩爾濃度成正比，因此化合物的1H-NMR峰面積可以代表其含量高低[9]。本研究以各成分的歸一化峰面積為指標，采用配對t檢驗評價上述成分在兩組樣品中的差異是否具有顯著性。結果發現，熏硫后白芷藥材中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量顯著降低（P<0.01或P<0.001），丙氨酸和亮氨酸含量顯著升高（P<0.01或P<0.001），而其余13種成分含量差異無統計學意義（P>0.05）。可見，以上6種差異成分為引起兩組樣品間差異的特征化學標志物，可用于熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。6種差異化合物在熏硫和未熏硫白芷樣品中的含量比較見圖4。

3 討論

本研究采用1H-NMR代謝組學技術，充分利用其方法學優勢，從整體層面上同時分析白芷藥材的化學成分，鑒定出了包括香豆素類、氨基酸類、糖類等在內的19種化學成分，所建立的1H-NMR圖譜可為白芷藥材的鑒定和質量控制提供新的技術手段。此外，結合PCA分析和t檢驗，發現白芷熏硫后其初級代謝產物（糖類、氨基酸類成分）和次級代謝產物（香豆素類成分）均發生了變化。其中，氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖、蔗糖、丙氨酸和亮氨酸被確定為白芷藥材的化學標志物，這6種成分可用于熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。雖然1H-NMR法所用儀器昂貴，但本文發現的主要標志物可用更加簡單、價廉的方法進行檢測，如可利用HPLC儀、氨基酸分析儀測定這些成分的含量，再通過與未熏硫白芷對照藥材進行比較，即可判斷市場上白芷藥材是否經過熏硫。

歐前胡素和氧化前胡素為白芷藥材的主要有效成分。現代藥理研究表明，歐前胡素具有明顯的鎮痛、抗炎和舒張血管等活性[15]，氧化前胡素也具有鎮痛、鎮咳及平滑肌解痙等作用[16]，這些藥理活性與白芷藥材的功能主治基本一致。本研究發現，白芷熏硫后其氧化前胡素和歐前胡素的含量明顯降低，表明藥材的質量明顯下降，可能會影響其臨床療效。除了香豆素類成分，本研究發現白芷熏硫后的初級代謝產物（糖類、氨基酸類成分）也發生了變化，其中糖類成分含量明顯降低，尤其是蔗糖，其含量降低了約60%。此外，與未熏硫白芷相比，熏硫白芷中含有更多的丙氨酸和亮氨酸，這與半夏藥材熏硫后氨基酸類成分含量有所升高的研究結果類似[17]。白芷熏硫后其糖類成分含量降低可能有利于藥材的貯藏、防蟲和防霉，但熏硫后糖類和氨基酸類成分的含量變化是否會影響白芷藥材的質量還需要進一步的研究。

綜上，本研究采用1H-NMR代謝組學技術研究了熏硫和未熏硫白芷的整體化學成分差異，結果表明，熏硫后白芷藥材的6種化學成分發生了明顯的變化，其中氧化前胡素、歐前胡素、葡萄糖和蔗糖含量明顯降低，而丙氨酸和亮氨酸含量明顯升高。因此，這6種成分可作為化學標志物，用于市場上熏硫和未熏硫白芷的客觀鑒別。

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（收稿日期：2020-03-03 修回日期：2020-04-19）

（編輯：林 靜）