間充質干細胞治療視網膜疾病作用機制的研究進展*

連曉倩 徐國興

(1.福建醫科大學附屬第一醫院;2.福建省眼科研究所,福建 福州 350005)

0 引言

間充質干細胞(Mesenchymal stem cell ，MSCs)是中胚層來源的具有自我更新能力和多向分化潛能的成體干細胞，最初由Fridenstein等在骨髓中發現，此后，又發現了不同來源的MSCs，如脂肪組織(ADSC)、牙髓、臍帶華通氏膠(huc-MSCs)、胎盤羊膜(hAD-MSCs)等[1]。MSCs是目前再生醫學研究領域最熱門的干細胞之一，具有神經營養作用、血管生成調節、免疫調節、抗炎、抗凋亡等多種功能。許多研究已經表明，MSCs在多種視網膜疾病的治療中發揮重要作用，包括糖尿病視網膜病變、視網膜退行性疾病、脈絡膜新生血管、視網膜缺血-再灌注等疾病。

1 MSCs治療視網膜疾病作用機制的研究進展

MSCs發揮視網膜保護作用的機制多種多樣，可能的主要機制是神經保護作用、免疫調節作用和血管生成調節作用，通過組合的方式修復或再生受損的視網膜組織，恢復視網膜功能。

1.1 神經保護作用

目前，較為大眾所知的MSCs介導的視網膜神經保護功能，一方面是MSCs通過特定微環境的誘導生成視網膜神經樣細胞，替代凋亡細胞；另一方面是MSCs通過旁分泌作用產生神經保護因子，如睫狀神經營養因子(CNTF)、腦源性神經營養因子(BDNF)、血小板源性生長因子(PDGF)和軸突生長相關蛋白-43(GAP-43)等[2-4]。此外，越來越多的證據表明，MSCs釋放的細胞外囊泡具有治療潛力[5-6]。根據其獨特的生物學組成，細胞外囊泡可分為微囊泡、微顆?；蛲饷隗w，它們在以旁分泌方式調節細胞間通信中發揮著重要作用[7]。MSCs來源的外泌體富含蛋白質、脂質和核酸。有研究發現，MSCs來源的外泌體在視網膜激光損傷的小鼠模型中具有修復和保護視網膜的作用。

近年來，出現另一種假說，即干細胞可將其自身的正常線粒體轉移到周圍線粒體受損的靶細胞，從而影響受損細胞的增殖、分化和衰老等過程。MSCs的線粒體轉移已在角膜細胞、星形膠質細胞和神經細胞等多種細胞中發現[8-10]。當線粒體損傷時，ATP合成不足，導致RGCs軸突萎縮，視覺功能受損，如Leber遺傳性視神經病變[11]。Jiang D等利用線粒體復合物I缺陷小鼠模型，即NDUFS4基因敲除小鼠模型，將誘導性多能干細胞源性間充質干細胞(iPSC-MSCs，用LV-mito-GFP標記線粒體)注射到小鼠玻璃體腔中，免疫熒光(IF)檢測發現小鼠視網膜的RGCs中表達LV-mito-GFP陽性線粒體，并且RGC的存活率較對照組明顯升高。說明iPSC-MSCs的線粒體能夠轉移到RGC中，并且對RGC具有保護作用[12]。

1.2 免疫調節作用

MSCs介導的免疫調節作用機制復雜，目前尚未完全闡明，可能的機制包括細胞-細胞間直接接觸，以及分泌生物活性物質，如生長因子、細胞因子和趨化因子等。MSCs可以抑制多種細胞的功能，包括巨噬細胞、中性粒細胞、自然殺傷(NK)細胞、樹突狀細胞(DC)、B淋巴細胞和T淋巴細胞。例如，在體內和體外，MSCs都能誘導巨噬細胞向M2型極化，并通過分泌抑制性細胞因子IL-10和/或TGF-β等下調免疫應答[13]。MSCs通過限制MHCII、CD1-α、CD40、CD80和CD86的表達來抑制單核細胞向樹突狀細胞的分化，并限制DC細胞的成熟[14]。MSCs對T細胞增殖的抑制作用也已被證實。特別是，MSCs被證明可以抑制CD4+T細胞分化為促炎性Th1和Th17細胞系，并促進CD4+CD25+Foxp3+調節性T細胞(Tregs)的生成，從而改善破壞性炎癥反應[15-16]。此外，MSCs還能調節中性粒細胞、NK細胞等，但目前這些方面的研究報道較少。

有趣的是，MSCs的免疫調節作用并不是天然固有的，研究發現，不同程度的炎癥介質會誘導MSCs極化分型并表現出截然相反的免疫調節作用，即免疫抑制或促進，這一特性稱為MSCs免疫調節的可塑性[17-18]。例如，在強炎癥狀態下，MSCs可以有效治療移植物抗宿主病(GVHD)，但是若將MSCs在骨髓移植同一天輸注，即炎癥反應尚未開始時，則治療效果不顯著。Ren等[19]發現MSCs發揮免疫抑制作用需要高濃度促炎因子的“授權”，主要包括IFN-γ、IL-1α、IL-1β和TNFα等促炎細胞因子。當高濃度的促炎因子存在時，能顯著提高MSCs分泌腫瘤壞死因子誘導基因6蛋白(TSG-6)、白細胞介素-1受體拮抗劑(IL-1Ra)、TGF-β、一氧化氮(NO)和吲哚胺2,3-氧合酶(IDO)等免疫調節因子的水平，從而發揮免疫抑制作用。而多種促炎因子同時存在可以產生協同增效作用[19]。究其原因，主要是低水平的炎癥因子不足以誘導MSCs高表達NO和IDO等免疫抑制因子，反而會刺激MSCs分泌大量趨化因子，從而招募淋巴細胞至其周圍，加劇炎癥反應[20]。

1.3 血管調節作用

通過血管修復性細胞治療，以取代或恢復受損的血管，正在成為干細胞治療缺血性視網膜病變的新策略。已有研究表明，MSCs能夠分化成內皮樣細胞，對視網膜血管病變起保護作用[21-23]。除此之外，MSCs還可以分泌血管生成相關因子調節視網膜疾病的血管生成，如血管內皮生長因子(VEGF)，成纖維細胞生長因子(FGF)，肝細胞生長因子(HGF)和轉化生長因子-b(TGF-b1)[24,25]。在氧誘導的視網膜病變小鼠模型中，研究者發現通過腹膜內移植的人胎盤羊膜來源的MSCs能有效歸巢并移植到受損部位，并且釋放血管生成相關因子，如TGF-β1[26]，TGF-β1水平的上調可以抑制內皮細胞增殖顯著減少新生血管形成[26]。2016年，Ezquer等人報道了在糖尿病小鼠模型中，MSCs通過分泌血小板來源的抗血管生成因子——血小板反應蛋白-1(Thrombospondin Type-1,TSP-1)發揮細胞保護作用[27]。TSP-1是一種糖蛋白，在健康的眼部微環境中調節MSC功能，包括抗血管生成、抗炎、免疫調節和免疫赦免活動，主要是由眼表上皮細胞(包括RPE、脈絡膜細胞和Muller膠質細胞)產生[27-29]。

然而，也有研究發現MSCs移植后眼中的病理性新血管反而加重。2010年的一項研究發現，骨髓來源的MSCs能選擇性地遷移并移植到脈絡膜新生血管旁，并進一步加重病理狀況[30]，其可能與MSCs分泌VEGF有關，眾所周知，VEGF可以刺激內皮細胞增殖和管狀結構形成，是促進視網膜新生血管形成的關鍵因子。有研究發現，MSCs表達VEGF的多少與微環境中炎癥蛋白的濃度有關，Ribot J等將大鼠骨髓來源的MSCs與內皮細胞共培養，發現當上清液中TNF-α和FGF濃度下降時，VEGF的表達也下降[31]。此外，BMSCs可分泌血小板反應蛋白-1(TSP-1)，TSP-1是一種功能強大的血管生成抑制劑，可通過Fyn和p38MAPK介導血管內皮細胞的凋亡[29]，此外TSP-1還可以通過招募特異性磷酸酶SHP-1到CD36-VEGFR2復合物中，從而抑制VEGF誘導的VEGFR2磷酸化和下游Akt信號通路[30]或下調基質金屬蛋白酶(MMPs)的表達[31]來減少血管生成。MSCs是良好的基因載體，因此，可以通過基因修飾增強血管抑制因子的表達來抑制視網膜新生血管的生成[32,33]。

2 問題與展望

間充質干細胞由于沒有倫理問題、易于分離和擴增以及低免疫原性的優勢，已成為細胞替代治療的一種有價值的工具。多項研究表明，MSCs對視網膜疾病的治療有益，但其具體的作用機制尚不完全明確，目前研究較多的是MSCs分化為視網膜細胞的能力，旁分泌恢復性營養因子和細胞因子，發揮免疫調節作用和血管調節作用。但如何準確調控MSCs的分化時相、選擇性分泌神經營養因子和抗血管生長因子，仍是治療的難點。除此之外，由于視網膜疾病的復雜性，加上動物模型的局限性，以及尚未證實的人體臨床試驗安全性，也為MSCs治療視網膜疾病的研究帶來了不確定性。因此，對MSCs的研究任重而道遠。