疏降飲對肝胃不和型反流性食管炎大鼠食管黏膜炎癥的影響

唐杜鵬 陳朝元

福建中醫藥大學附屬人民醫院，福建省福州市 350004

胃食管反流病(Gastro-esophageal reflux disease, GERD)是指胃內容物反流到食管、口腔(包括喉部)或肺部引起的一系列癥狀或并發癥[1-2]。GERD是一種常見的臨床慢性病，高達40%的世界人口每月至少患1次[3]。亞洲胃食管反流的患病率低于歐美，但我國發病率正在逐年上升[4-5]。反流性食管炎(Reflux esophagitis, RE)是GERD的典型癥狀，胃酸、膽汁鹽和其他有毒物質的回流被認為是RE的主要原因[6]。疏降飲是陳朝元教授依據自身治療肝胃不和型RE的臨床經驗加減優化而成，該自擬方不會對患者造成明顯的不良反應[7]，然而，其治療機制尚待闡明。

1 材料與方法

1.1 材料 水合氯醛(北京金橋生物工程有限公司)，塑料扎線(浙江誠成塑料有限公司)，臺式低溫高速離心機(Beckman，美國)，動物手術器械包，2-0和3-0縫線(中國上海金環醫療用品有限公司)。

1.2 疏降飲組成及制備 柴胡12g、白芍9g、旋覆花15g(包煎)、代赭石15g(打碎先煎)、黨參10g、白術12g、黃連6g、牡丹皮9g、砂仁6g(后入)、木香6g(后入)、煅瓦楞子15g(打碎先煎)、海螵蛸15g(打碎先煎)、炙甘草6g，上述方藥組成的疏降飲由福建中醫藥大學附屬人民醫院藥劑科統一由煎藥機煎制，分裝保存于4℃冰箱中。

1.3 實驗方法

1.3.1 實驗動物分組及模型制備：健康雄性Sprague-Dawley大鼠30只，體重(230±15)g，均購于福建醫科大學實驗動物中心，許可證號SCXK(閩)2017-0001。均按照福建醫科大學動物試驗中心的標準和要求進行喂養。30只大鼠隨機分為模型組、干預組及正常對照組(假手術組)，每組10只。術前置于網格底鏤空飼養籠中喂養，禁食禁水24h后使用10%水合氯醛腹腔注射麻醉，腹部朝上固定于自制固定板上，剔除腹部毛發,碘伏嚴格消毒，鋪設無菌洞巾，在上腹部做1.5cm的中線切口。前胃用2-0不可吸收縫線結扎，幽門用自制的尼龍環部分結扎幽門至直徑4.2mm，操作過程應輕柔，以防大出血甚至穿孔，經腹腔注射5%甲硝唑1ml和慶大霉素0.5ml后用3-0不可吸收縫線縫合切口，整個手術過程嚴格遵守無菌制度。假手術組，開腹后胃及十二指腸等組織不作任何手術，僅置于腹腔外3min后關腹。術后每天早上9點，取大小夾力一致的鐵夾夾住每只大鼠的尾巴的中1/3部位，以激怒大鼠、使其相互廝打，10min后更換1次夾子的位置，避免缺血造成損傷，每次刺激持續30min，1次/d。上述操作方法可制成肝胃不和型RE大鼠模型，所有操作按我國善待實驗動物的規定執行。

1.3.2 給藥干預：于造模2周后，每日上午10點，正常對照組及模型組均予1ml/100g體重量蒸餾水灌胃，干預組以1ml/100g疏降飲灌胃給藥，給藥時間連續2周。給藥時藥物解凍并加熱到25℃左右。

1.3.3 術后觀察：術后每日記錄各組大鼠精神狀態、活動、食量的變化，測量大鼠體質量，分析死亡大鼠的死因。

1.3.4 標本的采集及檢測：造模、干預4周后大鼠安樂死，迅速取出食管，生理鹽水洗滌后擦干，儲存于液氮中用于檢測mRNA表達水平。食管組織中相關指標mRNA的檢測按照Takara逆轉錄擴增試劑盒說明書采用Trizol法提取總RNA，相關的引物序列如表1所示。

表1 RT-PCR引物序列

檢測步驟如下：在初步實驗中確定了每組引物的對數擴增階段的條件，包括在95℃下初始步驟5min，然后95℃下30s，60℃下30s，72℃下30s，40個循環，最后在72℃下延長步驟5min，采用2%瓊脂糖凝膠電泳對PCR產物進行粒徑分離。PCR產物的大小由凝膠文件系統(美國加州紫外線產品有限公司)測定，通過與對照組比較，確定相對表達水平。

1.4 統計學方法 采用SPSS20.0統計軟件分析數據，計數資料以構成比表示，結果用χ2檢驗進行分析；計量資料用學生t試驗(Student’st-test)，檢驗水準α=0.05，以P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大鼠造模后存活情況 大鼠死亡主要發生在術后第1周內，2周后大鼠未見死亡，解剖后發現其主要死因是反流導致的吸入性肺炎。各組大鼠存活率如表2所示。各組大鼠成活率差異無統計學意義(P>0.05)，說明我們的造模方法穩定，且術后成活率較高。

表2 各組大鼠術后4周存活率比較

2.2 大鼠體重及食量變化 術后第1周內，大鼠精神狀態均較差、不好動、拒絕進食、毛發較臟，術后10d左右逐漸恢復正常飲食，精神、活動狀態及毛發光澤好轉，具體變化如表3所示。術前各組大鼠的基線情況一致(P術前食量>0.05,P術前體重>0.05)。造模后第1周內，造模組及干預組較對照組大鼠食量及體重均有所下降，但干預組和模型組比較提示組間無差別(P>0.05)。術后第2周開始食欲及體重逐漸增加，與模型組相比,干預組、對照組大鼠進食量、體重均增加，差異有統計學意義(P<0.05), 而干預組與對照組相比則無差別(P>0.05)。

表3 各組大鼠手術前后進食及體重變化比較

2.3 大鼠食管組織IL-1β、IL-8及TNFα mRNA表達情況 與正常對照組比較，干預組、模型組IL-1β、IL-8和TNFα的mRNA均明顯增多，差別有統計學意義(P<0.05)；但干預組中表達較模型組低，差別有統計學意義(P<0.05)，具體如表4所示。

表4 各組大鼠食管IL-1β、IL-8及TNFα mRNA表達

3 討論

RE是現代醫學名稱，在中醫中并沒有確切對應的病名，根據中醫辨證分型將其分為肝胃不和型、肝胃郁熱型、脾虛氣逆型、痰濕中阻型、氣虛血瘀及寒熱錯雜型[8-9]。在本研究中，采用前胃結扎聯合不全幽門梗阻術疊加夾尾刺激，模擬了RE患者“肝郁氣滯、胃氣上逆”的中醫病機，建立肝胃不和型RE大鼠模型，手術2周后無大鼠死亡，提示模型已穩定，故我們在第3周開始用藥干預，該模型手術簡單易學，易于復制，且生存率高。

大鼠的體重及進食量是反映大鼠生存狀態的重要指標，術前各組大鼠基線一致，術后第1周，模型組及干預組較對照組大鼠食量及體重均有所下降，但干預組和模型組比較提示組間無差別，考慮術后第1周的食量、體重下降主要與術前的禁食禁水、手術創傷等有關，術后第2周開始大鼠食欲及體重逐漸增加，與模型組相比,干預組、對照組大鼠進食量、體重均明顯增加，提示干預組大鼠應用疏降飲治療后生存質量明顯改善。

IL-1β、IL-8和TNFα是機體內重要的炎性因子，既往傳統觀點認為是反流的胃內容物對食管黏膜的化學損傷導致了RE的發生和進展，但該假說逐漸被摒棄，近年來，細胞因子介導食管上皮免疫炎性反應導致RE的假說逐漸得到大家的認可[10-11]。在本研究中干預組與模型組IL-1β、IL-8和TNFα的mRNA水平均明顯升高，證實了炎癥反應參與了RE的發展，但具體機制仍不明確。大量研究指出蛋白酶激活受體2(Protease-activated receptor 2, PAR-2)廣泛存在于人體的各個組織[12]，在炎癥、免疫、應激等病理過程中發揮重要作用[13-15]，PAR-2可通過PI3K-PKB-NF κB這一信號通路而促進內皮細胞中IL-1β、IL-6、IL-8和TNFα等促炎因子的表達與釋放[16]，亦有學者指出氧化應激參與大鼠RE模型中食管黏膜的損傷[17-19]。

肝胃不和型RE發病的根本病機在于肝郁氣滯、胃氣上逆，應用中醫理論陰陽平衡辨證論治，根據中藥配伍規律，疏降飲方中多味中藥相互補充，疏肝解郁、和胃降逆，取得了良好的療效。

綜上所述，疏降飲對肝胃不和型RE大鼠可明顯改善體重、增加食量、減輕食管炎癥損傷，但其作用機制尚不明確，PAR-2激活PI3K-PKB-NF κB通路及氧化應激反應有可能是其未來研究的方向。