miR-125b靶向調節p53表達對生精細胞發育能力的影響*

謝 麗 彭鳳蘭

長沙衛生職業學院，湖南省寧鄉縣 410600

精子發生需要經歷復雜而有序的一個過程，在發育階段的特異性基因表達以及調控屬于正常精子得以形成的分子基礎[1]。目前，通過對不同基因修飾小鼠模型展開深入研究，已經鑒定出了400余個與精子發生異常具有一定關系的基因，表明多種基因在精子發生過程中會出現特異性表達，并且具有功能，但其具體調節機理尚需展開深入研究[2]。miR-125b是miR-125家族中的一員，已被證實在不同生物過程中起著重要的作用，分析和鑒定生精細胞中miR-125b中靶基因，對于研究miR-125b對生精細胞的影響有重要意義[3]。p53為凋亡基因中第一種，研究發現生精細胞中miR-125b的靶基因可能為p53[4]。但miR-125b在生精細胞發育過程中的作用及機制尚不明確，因此本課題通過對小鼠生精細胞培養模型，探究miR-125b靶向調節p53表達對生精細胞發育能力的影響及作用機制。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 實驗動物：選取出生7d的清潔級健康小鼠，購于北京實驗動物中心，此次試驗嚴格參照《中華人民共和國實驗動物管理條例》中的規定流程展開，且符合倫理要求。

1.1.2 實驗藥品及器材：細胞培養基由Hyclone公司提供；磷酸緩沖鹽溶液均購于武漢博士德生物工程有限公司；膠原酶Ⅳ以及胰酶均購于Sigma公司；四甲基偶氮唑鹽由Beyotime Biotechnology 公司提供；二甲基亞砜由Ameresco公司提供。

1.2 方法

1.2.1 原代培養支持細胞：以頸椎脫臼法將小鼠處死，無菌取出睪丸，放入培養皿內，以磷酸緩沖鹽溶液對睪丸表面附著的血液進行沖洗后，倒入新磷酸緩沖鹽溶液，以鑷子、剪刀對小鼠白膜進行去除，并剪碎睪丸，以2g/L膠原酶Ⅳ及2g/L胰酶依次對睪丸組織進行低溫下消化。予以離心后，取上清液，再制備單細胞懸液，將其接種至培養瓶內，放置于二氧化碳培養箱中進行孵育，2h即可，當細胞貼壁后，對培養基進行置換，予以培養過夜，并對細胞狀態進行定期觀察，對細胞培養基及時更新，待細胞達到單層鋪滿狀態后，以磷酸緩沖鹽溶液進行3次清洗，予以胰酶消化，以計數板進行準確計數，并重新接種。

1.2.2 四甲基偶氮唑鹽法測定細胞增殖：以四甲基偶氮唑鹽法對96孔板中的細胞接種數量進行控制，維持1×105個/L，并于每組中均設置為5個重復，各孔的接種量控制為200μl。對96孔板進行輕柔晃動，于37℃環境中放置于二氧化碳培養箱內予以培養2d后取出，分別于每孔中加入20μl四甲基偶氮唑鹽，搖勻后置于二氧化碳培養箱內再次予以4h培養，將上清液去除后，于每孔中加入150μl 二甲基亞砜，以酶聯免疫檢測儀對490nm處的吸光度進行測定。

1.2.3 免疫印跡試驗：于6孔板中對250μl支持細胞進行接種，放入培養箱中進行培養2d，待胰酶消化，對細胞進行收集，以磷酸緩沖鹽溶液進行清洗，并離心處理，取沉淀組織，對細胞進行低溫裂解，經十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳。

1.2.4 實時熒光定量—聚合酶鏈式反應：于6孔板中對250μl支持細胞進行接種，放入培養箱中進行培養，當細胞貼壁達到單層覆蓋后，提取RNA，予以反轉錄，并進行實時熒光定量—聚合酶鏈式反應，經十二烷基硫酸鈉—聚丙烯酰胺凝膠電泳，對p53進行測定。

1.3 數據處理 以GraphPad Prism 5軟件對四甲基偶氮唑鹽法和實時熒光定量—聚合酶鏈式反應數據進行分析。

2 結果

2.1 miR-125b對支持細胞的影響 給予小鼠原代支持細胞組織相應對照、轉染miR-125b inhibitor及miR-125b mimic后，予以實時熒光定量—聚合酶鏈式反應檢測，發現miR-125b過表達且被敲低，見圖1-①。經四甲基偶氮唑鹽法與免疫印跡試驗，顯示轉入miR-125b mimic后，小鼠的支持細胞增殖能力明顯增加，見圖1-②；而轉入miR-125b inhibitor后，小鼠的支持細胞增殖能力明顯衰退，見圖1-③。

2.2 miR-125b對p53表達的影響 免疫印跡試驗及實時熒光定量—聚合酶鏈式反應結果發現，miR-125b inhibitor對于p53表達起著促進作用，而miR-125b mimic對p53表達起著抑制作用，見圖2。

2.3 p53表達對支持細胞的影響 于小鼠支持細胞中進行p53 小干擾RNA-1、2、3轉染，并以實時熒光定量—聚合酶鏈式反應進行檢測，結果發現小干擾RNA-2及小干擾RNA-3對于p53表達的沉默效果十分顯著，見圖3-①，再對小干擾RNA-3細胞組織進行四甲基偶氮唑鹽試驗，發現敲低p53后，小鼠的支持細胞增殖能力會明顯升高，見圖3-②。

3 討論

近年來，隨著社會化工業化程度的進一步提高，環境污染問題愈發嚴重，不孕不育發生率不斷升高，已成為影響人類社會的常見病癥[5]。研究[6]發現，育齡夫婦中，不孕不育的發生率已達到10%～15%，其中由男方因素所致不孕不育的占有比為50%，且大多患者的病因、發病機制并未明確。精子發生是一個十分高效的過程，正常情況下，健康男子平均每秒可產生數千顆精子，然而僅少數精子的形態正常，并且還呈現出逐年下降趨勢[7]。世界衛生組織預測，男性不育問題愈加嚴重，即將發展為僅次于腫瘤及心腦血管病的第三大疾病，且會成為生殖健康領域工作研究中的重要項目[8]。

圖1 miR-125b促進支持細胞組織增殖

圖2 miR-125b下調p53表達

圖3 p53促進支持細胞組織增殖

當前，隨著以體外受精技術為代表的現代化新型輔助生殖技術的進一步發展與完善，不育癥患者已獲取到擁有自己后代的機會，盡管生殖醫學新時代已經到來，但是各種輔助性受孕技術繞過了受精過程中對潛在具有遺傳缺陷的異常精子的自然選擇機制，因此可能使后代遺傳缺陷[9]。鑒于此，對男性不育的發生因素以及分子機制展開深入分析，并根據分析結果提出切實可行的診治措施顯得尤其關鍵。microRNA(miRNA)是一類新發現的短片段，已逐漸成為生物學中的研究重點，miRNA可與靶基因mRNA產生相互作用，使靶基因mRNA的穩定性有效降低，在細胞增殖、發育及分化等過程中均起著關鍵性作用[10-11]。研究[12]表明，男性生精細胞組織內存在大量miRNAs表達，且對精原細胞組織分析及自我更新產生調節作用。miR-125b屬于miR-125家族成員，有2個前體，即pre-miR-125b-1以及pre-miR-125b-2，其編碼基因分別位于11號和21號染色體上[13]。本次研究通過創建小鼠模型，發現miR-125b可使p53表達下調，p53表達是miR-125b的靶基因。將p53的小干擾RNA轉染支持細胞后，發現p53基因沉默可對支持細胞組織增殖產生促進作用。miR-125b能夠下調BMF，而BMF屬于Bcl-2屬于促凋亡家族中的成員，當BMF下調后，對于細胞轉移以及細胞增殖均可起到促進作用，因此miR-125b表達表現出組織器官差異性特征，通過對細胞增殖凋亡相關的p53基因表達進行調節，促使細胞的增殖及凋亡能力發生變化，提高生精細胞發育能力[14-15]。

綜上所述，miR-125b通過靶向調節p53表達，從而促進生精細胞發育能力的提升。