山葡萄皮花色苷提取工藝優(yōu)化及其組分分析

王鑫，韓茜宇*，薛宏坤

1. 大理大學公共衛(wèi)生學院（大理 671003）；2. 黑龍江國際旅行衛(wèi)生保健中心（哈爾濱 150090）；3. 清華大學工程物理系，粒子與輻射成像教育部重點實驗室（北京 100084）

“雙豐”山葡萄為葡萄科葡萄屬植物，具有顯著的抗寒、抗旱特點，被廣泛種植于中國東北地區(qū)，其果實柔軟多汁，風味獨特，且含有豐富的天然活性成分，備受人們喜愛[1]。“雙豐”山葡萄主要用于制作果汁和果酒，在產品制作過程中，葡萄皮通過作為副產物（占整個葡萄的10%）被大量遺棄，造成環(huán)境污染和資源浪費。葡萄皮中富含大量花色苷、多酚、維生素、超氧化物歧化酶等活性成分，可作為天然活性成分的重要來源。因此，如何將副產物變廢為寶已成為科研關注熱點。

花色苷是葡萄皮中重要的活性成分之一，其基本結構單元為C6—C3—C6骨架構成的2-苯基苯并吡喃[2]，結構如圖1所示。因獨特的結構使其具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、預防心血管疾病和增強視力等功效[3]。如何高效地從“雙豐”山葡萄皮中提取花色苷，從而提高山葡萄的附加值，已成為科研人員亟待解決的問題。花色苷提取主要采用傳統(tǒng)的浸提法，該方法存在效率低、耗時長、萃取溶劑消耗量大、后期易造成熱敏性物質的降解等問題[4]，無法滿足對高效率和高得率花色苷的需求。超聲輔助提取法作為一種新型的植物活性成分提取技術，利用超聲波的空化效應、熱效應、機械效應加速細胞壁破裂，減小目標成分的擴散阻力，使細胞內的目標成分更容易從細胞中擴散到周圍溶劑，從而有效提高目標成分得率[5-6]。因此，該技術被廣泛應用于黃酮[7]、多酚[8]、多糖[9]、油類[10]等的提取。而關于采用超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的研究鮮見報道。

圖1 花色苷的基本結構[2]

鑒于此，采用超聲輔助提取技術對“雙豐”山葡萄皮花色苷進行提取，探究超聲功率、超聲時間、提取溫度、料液比對花色苷得率的影響，并通過正交試驗優(yōu)化其提取工藝；在此基礎上，采用高效液相色譜-質譜聯(lián)用技術對“雙豐”山葡萄皮花色苷組分進行鑒定，以期提高“雙豐”山葡萄的附加值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

“雙豐”山葡萄（東北小興安嶺地區(qū)），成熟后于8月中旬采摘，除雜、清洗、晾干、去皮，果皮置于-20 ℃的冷凍干燥機凍至48 h，然后用植物粉碎機將其粉碎，過40目篩，制成“雙豐”山葡萄皮粉末，密封避光保存在-18 ℃冰箱中備用。

甲酸、乙腈、甲醇、乙醇（均為色譜純，美國Fisher公司）；矢車菊素-3-葡萄糖苷標準品（純度≥95%，美國諾威公司）；醋酸纖維素膜（0.45 mm，天津市科密歐化學實劑有限公司）；AB-8大孔樹脂（日本三菱公司）。

1.2 儀器與設備

KQ600DB超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；220D電子分析天平（上海力辰儀器科技有限公司）；J-HH-6A精密數(shù)顯恒溫水浴鍋（上海勝衛(wèi)電子科技有限公司）；LAMBDA35型紫外分光光度計（美國Perkin Elmer公司）；SHB-ⅢA型循環(huán)水式多用真空泵（鄭州紫拓儀器設備有限公司）；DRYER真空冷凍干燥器（德國西門子公司）；Agilent1260高效液相色譜-布魯克質譜聯(lián)用儀（美國Agilent公司）。

1.3 方法

1.3.1 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷

準確稱取2.000 0±0.000 5 g經1.1所制得的“雙豐”山葡萄皮粉末置于真空包裝袋中，按照不同料液比加入體積分數(shù)60%乙醇溶液[11]，使其充分混合，封口，將其放入超聲設備中進行提取，同時固定不同提取溫度，提取結束后，將萃取液置于離心機中以5 000 r/min離心15 min，收集上清液，然后將所得的殘渣重復上述操作提取2次，合并3次所得濾液，隨后用醋酸纖維素膜（0.45 mm）過濾，所得的濾液置于4 ℃冰箱避光保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的單因素試驗

稱取2.000 0±0.000 5 g“雙豐”山葡萄皮粉末樣品作為提取對象，選擇體積分數(shù)60%乙醇作為提取溶劑，考察不同超聲功率、提取時間、提取溫度和料液比對“雙豐”山葡萄皮粉末中花色苷含量的影響。在預試驗基礎上，設定超聲功率100，200，300，400和500 W 5個水平；超聲時間20，25，30*，35和40 min 5個水平；提取溫度30，40，50*，60和70 ℃ 5個水平；料液比1∶10，1∶20，1∶30*，1∶40和1∶50（g/mL），每組試驗重復3次。（注：*表示當考察其他參數(shù)對“雙豐”山葡萄皮粉末花色苷含量影響時，用*標記的因素保持恒定水平。）

依據(jù)單因素試驗結果，設計L9(33)正交試驗，正交試驗因素及水平編碼如表1所示。

表1 超聲輔助提取山葡萄皮粉末花色苷的L9(33)正交試驗因素及水平

1.3.3 花色苷含量的測定

采用pH示差法測定樣品中花色苷含量，參考于澤源等[12]的方法并略做改動。取1 mL樣品，分別加入9 mL pH 1.0氯化鉀緩沖液和9 mL pH 4.5乙酸鈉緩沖液，將其混合，避光靜置1 h，分別在520和700 nm處測定其吸光度，花色苷的含量表達式如式（1）所示。

式中：c為樣品中花色苷含量，mg/g；A為樣品提取液的吸光度；DF為稀釋倍數(shù)；Mw為矢車菊素-3-葡萄糖苷的相對分子質量，449.2；Ma為矢車菊素-3-葡萄糖苷的消光系數(shù)，26 900；L為比色皿光程，cm；V為總體積，mL；m為樣品質量，g。

1.3.4 HPLC-ESI/MS法對“雙豐”山葡萄皮粉末花色苷組分鑒定

樣品準備：在最佳工藝條件下獲得的“雙豐”山葡萄花色苷提取液，將其在50 ℃旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，準確移取20 mL山葡萄皮花色苷濃縮液，并將其注入已活化的AB-8大孔樹脂柱（2.6 cm×60 cm）中充分吸附，進樣流速1.5 mL/min，進樣完全后，依次用酸化的去離子水（0.01% HCl）、30%乙醇溶液（0.01% HCl）和95%乙醇溶液（0.01% HCl）洗脫，洗脫流速1.0 mL/min，收集洗脫液，將其在50 ℃旋轉蒸發(fā)儀減壓濃縮，得到山葡萄皮花色苷純化液，將其在冷凍干燥機中凍干成粉，將其用0.1% HCl-甲醇溶液稀釋后，配制成濃度為0.1 mg/mL的樣品溶液，溶液過0.45 μm濾膜，用于HPLC分析。

色譜條件：Aglient 1260 C18柱（150 mm×4.6 mm，2.6 μm）；流動相A為體積分數(shù)5%甲酸水溶液，流動相B為乙腈-水-甲酸（體積比61.5∶37∶2.5）。洗脫程序：0～5 min，5%～20%流動相B，保持5 min；5～15 min，20%～25%流動相B，保持5 min；15～25 min，25%～30%流動相B，保持5 min；25～35 min，30%～5%流動相B，保持5 min；流速0.8 mL/min；柱溫25 ℃；進樣量25 μL；檢測波長520 nm。

質譜條件：電噴霧電離離子源（ESI），質譜采用正離子掃描方式，質量掃描范圍m/z200～2 000，毛細管電壓4.5 kV，霧化器壓力1.5 bar，干燥溫度220 ℃。

1.3.5 數(shù)據(jù)處理

每組試驗重復3次，結果用“平均值±標準差”表示；采用SPSS 16.0軟件對每組試驗數(shù)據(jù)進行方差分析（ANOVA）；采用SAS 8.0軟件分析結果的顯著差異；Origin 9.0進行繪圖。

2 結果與分析

2.1 單因素對“雙豐”山葡萄皮花色苷含量的影響

超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的單因素試驗結果如圖1所示。

由圖2（A）可知，超聲功率100～300 W時，隨超聲功率增加，花色苷得率呈顯著增加趨勢（p＜0.05），在300 W時，花色苷得率取得最大值（0.62±0.03 mg/g），其原因是隨超聲功率增加，機械震動效應和空化效應顯著增加，使得在萃取液中產生較大剪切力，引起山葡萄皮細胞壁破裂，傳質阻力降低，擴散系數(shù)增加，進而促進花色苷從山葡萄皮細胞中快速擴散出來[13]。隨后繼續(xù)增加超聲功率，花色苷得率呈現(xiàn)顯著降低趨勢（p＜0.05）。這歸因于在過高的超聲功率下，高強度的空化效應破壞花色苷結構，同時也會引起非花色苷類雜質的溶解，導致花色苷溶解度降低[14]，從而使得花色苷得率呈現(xiàn)顯著降低趨勢。故選擇超聲波功率為200，300和400 W作為后續(xù)正交試驗的因素水平。

由圖2（B）可知，超聲時間20～30 min時，花色苷得率隨超聲時間延長呈現(xiàn)顯著增加趨勢（p＜0.05），隨后繼續(xù)延長超聲時間，花色苷得率無顯著變化（p＞0.05）。其原因是在萃取初期，花色苷在細胞內外的濃度梯度較大，有利于花色苷從細胞中擴散到周圍溶劑中，使得花色苷得率顯著增加。進一步延長超聲時間，可能由于萃取液中花色苷濃度與山葡萄皮細胞內花色苷濃度一致，內外濃度梯度趨近于零，即萃取液中花色苷達到飽和狀態(tài)。因此，進一步延長超聲時間，花色苷得率基本保持不變，故超聲時間設定為30 min，后續(xù)不再優(yōu)化超聲時間。

由圖2（C）可知，隨提取溫度增加，花色苷得率呈現(xiàn)先顯著增加后顯著降低趨勢（p＜0.05），提取溫度50 ℃時，花色苷得率取得最大值（0.68±0.01 mg/g）。其原因是隨提取溫度增加，萃取液黏度降低，擴散系數(shù)和溶解度增加，使得花色苷更容易從細胞中被擴散出來[15]，故花色苷得率增加。繼續(xù)增加提取溫度不利于花色苷提取，這是由于花色苷屬于熱敏性成分，高溫破壞花色苷與糖分子形成的糖苷鍵，引起花色苷呈指數(shù)形式降解[16]，從而使花色苷得率降低，故提取溫度選擇40，50和60 ℃作為后續(xù)正交試驗的因素水平。

由圖2（D）可知，料液比1∶10～1∶30（g/mL）時，花色苷得率隨料液比增加呈現(xiàn)顯著增加趨勢（p＜0.05），其原因是隨萃取溶劑增加，細胞內外花色苷濃度梯度增加，濃度梯度作為花色苷傳質驅動力，較大的濃度梯度驅動有利于花色苷由內向外擴散，從而增加花色苷得率。料液比超過1∶30（g/mL）時，繼續(xù)增加料液比，花色苷得率則呈現(xiàn)顯著降低趨勢（p＜0.05）。歸因于過多溶劑會產生雜質、色素等，降低花色苷的溶解度，從而不利于花色苷的提取[17]；另外溶劑過大，會對后續(xù)提取物的濃縮帶來很大的工作量。因此，綜合考慮，料液比選擇1∶20，1∶30和1∶40（g/mL）作為后續(xù)正交試驗的因素水平。

圖2 超聲功率（A）、超聲時間（B）、提取溫度（C）和料液比（D）對山葡萄皮花色苷含量的影響

2.2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的正交試驗結果

超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的正交試驗設計及結果如表2所示。通過極差大小確定各因素對花色苷得率影響的主次順序：C＞A＞B。最優(yōu)水平組合為A2B3C3，即超聲功率300 W、提取溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。對最優(yōu)試驗條件進行3組平行試驗驗證，在最優(yōu)參數(shù)組合下山葡萄皮花色苷得率為0.71±0.03 mg/g，說明超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷工藝得到優(yōu)化。

表2 超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的L9(33)正交試驗設計及結果

2.3 “雙豐”山葡萄皮花色苷組分鑒定

在最佳參數(shù)組合下所得花色苷粗提液，經AB-8大孔樹脂純化后所得樣品，再經HPLC-ESI/MS分析，其結果如圖3、圖4和表3所示。

由圖3可知，山葡萄皮粗提液經AB-8大孔樹脂純化后得到3種花色苷組分，結合各組分的色譜保留時間、分子離子峰和丟失的碎片來共同判斷3種花色苷組分的組成。圖3中1號峰的質譜圖如圖4（A）所示，分子離子[M+]為465.0，碎片離子m/z303.1，其中m/z303是飛燕草素的特征離子，丟失的碎片m/z162，可能為葡萄糖和半乳糖，結合資料分析[18]，最終可判定1號峰為飛燕草素-3-葡萄糖苷。圖3中2號峰的質譜圖如圖4（B）所示，分子離子[M+]為449.0，碎片離子m/z287.1，m/z287是矢車菊素的特征離子，丟失的碎片162，研究結果與Pertuzatti等[19]研究高叢藍莓花色苷中的矢車菊素-3-葡萄糖苷的質譜信息相一致。因此，2號峰為矢車菊素-3-葡萄糖苷。圖3中3號峰的質譜圖如圖4（C）所示，分子離子[M+]為625.2，碎片離子m/z463.1和m/z301.2，可能是由分子離子失去一分子己糖苷（Δm/z162）而成，m/z463.1和301.3之間也相差一個分子量162的己糖苷，且m/z301是芍藥素色素的特征離子，推測3號峰物質可能是帶有兩個己糖苷的芍藥色素花色苷。該研究結果與Wang等[20]在相同高效液相色譜-質譜檢測條件下鑒定出芍藥素-3, 5-二己糖苷的質譜信息一致。因此，最終判定3號峰為芍藥素-3, 5-二己糖苷。

圖3 經AB-8大孔樹脂純化后所得山葡萄皮花色苷組分的液相色譜圖

圖4 花色苷組分質譜圖

表3 山葡萄皮花色苷種類鑒定表

3 結論

在單因素試驗基礎上，通過正交試驗優(yōu)化出超聲輔助提取“雙豐”山葡萄皮花色苷的工藝：超聲功率300 W、超聲時間30 min、提取溫度60 ℃、料液比1∶40（g/mL）。在此條件下花色苷得率為0.71±0.03 mg/g，經HPLC-ESI/MS鑒定發(fā)現(xiàn)山葡萄皮中包含3種花色苷組分。試驗結果有助于提高“雙豐”山葡萄的附加值，同時可為天然花色苷保健品的開發(fā)提供物質基礎。