櫻桃果醋深層液態發酵工藝

劉寶祥，蘇政波，馬闖，鄭召運，鄭偉，張作利

1. 齊魯工業大學（山東省科學院），山東省食品發酵工業研究設計院（濟南 250013）；2. 山東愛櫻維生態農業有限公司（日照 262300）

櫻桃的營養成分非常豐富、味道鮮美，除了正常水果所含有多種維生素和礦物質等成分外，也富含花青素、各種花色苷、褪黑素、槲皮素、異槲皮素等其他成分。櫻桃在預防心腦血管疾病，尤其是慢性病過程中發揮著重要作用[1-2]。由于櫻桃水分高，皮薄、肉軟，組織嬌嫩，采摘后不易儲存，導致櫻桃極易變味、變質而失去價值[3]。隨著櫻桃產量的增加、人們對產品品質要求的提高，開發櫻桃醋等高附加值、易儲存的產品成為一種趨勢。

果醋是以果品或加工下腳料為主要原料，利用微生物發酵技術釀制的一種營養豐富、風味優良的酸性飲品或調味品。具有抑菌、緩解體力疲勞、抗氧化、預防肥胖和高脂血癥、干預酒精中毒引起的代謝失調等作用，具有廣泛實用性[4-5]。果蔬釀醋和糧食釀醋相比具有營養豐富、保健價值高、風味好、更適于開發醋酸飲料等獨特的優越性。通過以果代糧釀制果醋，既可以利用果蔬資源，同時又可節約糧食，對提升中國果品資源優勢具有顯著意義，也是釀造業發展和提升的方向之一[6]。

櫻桃果醋在原有營養的基礎上，果汁中的營養物質經過酵母菌和醋酸菌的發酵，更好地被人體吸收；高效萃取櫻桃果漿中的生物活性物質，并富含醋酸、琥珀酸、氨基酸等生物活性成分，能夠賦予櫻桃更好的感官品質和經濟價值[7-11]。

試驗以山東日照產新鮮櫻桃為原料，研究櫻桃果醋的發酵工藝并通過HPLC檢測有機酸的主要組成成分，為相關企業開發櫻桃相關產品提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

櫻桃（山東省日照市五蓮山“紅燈”櫻桃）；白砂糖（市售）。

果膠酶（諾維信生物技術有限公司）；果酒酵母（湖北安琪酵母有限公司）；醋酸菌（實驗室保藏）；氫氧化鈉、鹽酸等（分析純）；標準品：乙酸、檸檬酸、蘋果酸、D-乳酸、琥珀酸、甘油等（含量均≥99.8%，美國Sigma公司）；產品用水為純凈水。

1.2 儀器與設備

料理機（廣東美的生活電器制造有限公司）；L550低速離心機（長沙湘儀離心機儀器有限公司）；生化培養箱（上海躍進醫療器械有限公司）；HZT2雙層振蕩器（哈爾濱市東聯電子技術開發有限公司）；電熱恒溫水浴鍋（北京醫療設備廠）；電子分析天平（梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司）；HPLC色譜儀（戴安UV3000）。

1.3 測定方法

1.3.1 殘糖量的測定

按照 GB 5009.7—2016《食品安全國家標準 食品中還原糖的測定》執行[12]。

1.3.2 酒精度的測定

按照 GB 5009.255—2016《食品安全國家標準 酒中乙醇濃度的測定》執行[13]。

1.3.3 總酸的測定

按照 GB/T 12456—2008《食品安全國家標準 食品中總酸的測定》執行[14]。

1.3.4 HPLC分析條件

色譜儀，戴安UV3000；檢測器，示差檢測器；色譜柱，Carbomix Ca-NP5，8%；流動相，超純水；流速0.8 mL/min；進樣量20 μL，柱溫80 ℃。

1.4 櫻桃果醋基本工藝

新鮮櫻桃→揀選→清洗→除?！ズ恕驖{→酶解→加糖→接種酵母菌→發酵→去渣→接種醋酸菌→發酵→調配→澄清→產品

醋酸菌斜面培養基：葡萄糖1 g、酵母膏1 g、瓊脂2 g、碳酸鈣0.5 g、無水乙醇3 mL、100 mL純凈水。

醋酸菌活化：從醋酸菌斜面，取1環接種于裝液75 mL 5%vol櫻桃酒的250 mL三角瓶中，于30 ℃ 200 r/min條件下培養24 h。

2 結果與分析

2.1 櫻桃酒制備

取適量新鮮櫻桃，去除其中的壞果、腐爛果和其他雜物，選擇成熟度良好、顏色深的新鮮櫻桃；手工摘除櫻桃的果梗，再去掉櫻桃核，稱取處理好的櫻桃1 kg加入料理機，直接將櫻桃果進行破碎、打漿；將打漿好的櫻桃加熱到50 ℃，加入一定量果膠酶，保溫并保持攪拌2 h；酶解好的櫻桃漿，加入200 g白砂糖溶解后，加入0.3 g焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，接種0.8g果酒酵母，于24 ℃條件下靜置發酵8 d，發酵結束后使用離心機以4 000 r/min離心10 min，得到上層清液；經檢測，酒精度為12.51%vol，還原糖含量9.7 g/L。

2.2 櫻桃果醋發酵條件的研究

2.2.1 初始酒精度對醋酸轉化率的影響

取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至需要的酒精度，分裝于滅菌的三角瓶中，裝液量75 mL/250 mL。分別接種5%種子液，于搖床30 ℃ 200 r/min條件下培養。

由圖1可以看出，醋酸菌接種后，總酸含量緩慢上升，說明醋酸菌處于延滯期，需要一段時間的適應和菌種增值；隨著發酵進行，發酵50 h總酸含量開始快速增長。初始酒精度為5%，6%，7%和8%vol的樣品分別在160，150，210和240 h左右，總酸含量達到最高峰。取其總酸含量最高值，計算其最高轉化率分別為65.38%，67.63%，63.36%和61.48%。初始酒精度6%vol的樣品轉化率最高，同時產酸速度最快。而7%和8%vol樣品最終總酸含量較高，但在初期產酸速度較慢，說明酒精度提高可能會抑制醋酸菌的活性，造成延滯期的延長，進而影響產酸速度，造成發酵時間延長，再加上酒精揮發，從而造成醋酸轉化率較低。所以，初始酒精度選擇6%vol。

圖1 不同初始酒精度對總酸含量的影響

2.2.2 接種量對發酵的影響

取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至酒精度6%vol，分裝于滅菌的三角瓶中，裝液量75 mL/250 mL。分別接種3%，4%，5%，6%和7%種子液，于搖床30 ℃200 r/min條件下培養。

由圖2可以看出，接種量對發酵速度有很大影響。接種量較?。?%種子接種量）時，初期產酸速度較慢；隨著接種量增大，產酸速度隨之增加；發酵后期，轉化率均可達到75%，但接種量較高也會造成后期的酸度損失變大。所以，考慮綜合因素，接種量選擇5%。

圖2 不同接種量對總酸含量的影響

2.2.3 發酵溫度的影響

取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至酒精度6%vol，分裝于滅菌的三角瓶中，裝液量75 mL/250 mL，接種5%種子液，分別于26，28，30，32和34 ℃條件下搖床200 r/min培養。

醋酸菌必須在合適的生長溫度條件下才能發揮最好作用[15]。溫度過低會造成發酵產酸速度過慢，溫度過高會造成醋酸菌的提前老化，也會影響產酸的速率。由圖3可以看出，發酵溫度較低時（26 ℃），醋酸菌產酸速度較慢，造成發酵時間延長，發酵周期的延長同時提高生產成本也加大后期風險。溫度較高時（34 ℃），發酵初期產酸速度較快，但隨著發酵進行，酒精和醋酸的揮發造成產酸率較低和資源的浪費。所以，發酵溫度選擇28 ℃。

圖3 不同發酵溫度對總酸含量的影響

2.2.4 搖床轉速和時間對發酵的影響

取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至酒精度6%vol，分裝于滅菌的三角瓶中，裝液量75 mL/250 mL，接種5%種子液，在28 ℃條件下分別于搖床轉速160，180，200，220和240 r/min培養。

由圖4可知，搖床轉速對發酵產酸速率的影響不大，說明在試驗范圍內達到菌體生長和乙醇酸化所需氧氣量。轉速較低時，發酵產酸速度較慢；隨著轉速增加，產酸速度加快，最終醋酸的轉化率差別不大。綜合考慮選擇搖床轉速220 r/min，培養時間192 h基本達到總酸最大值。

圖4 不同搖床轉速對總酸含量的影響

2.2.5 櫻桃果醋發酵條件驗證試驗

取適量新鮮櫻桃，去除其中的壞果、腐爛果和其他雜物，選擇成熟度良好、顏色深的新鮮櫻桃；手工摘除櫻桃的果梗，去除櫻桃核，處理好的櫻桃稱取1 kg加入料理機，直接將櫻桃果進行破碎、打漿；打漿好的櫻桃，加熱到50 ℃，加入一定量果膠酶，保溫并保持攪拌2 h；酶解好的櫻桃漿，加入200 g白砂糖溶解后，加入0.3 g焦亞硫酸鈉，攪拌均勻，接種0.8 g果酒酵母，于24 ℃條件下靜置發酵8 d，發酵結束后使用離心機以4 000 r/min離心10 min，得到上層清液；經檢測，酒精度12.51%vol，還原糖含量9.7 g/L。取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至酒精度6%vol，分裝于滅菌的三角瓶中，裝液量75 mL/250 mL，接種5%種子液，28 ℃條件下于搖床轉速220 r/min培養192 h，檢測總酸含量為46.38 g/L。

綜上所述，櫻桃果醋搖床發酵最佳工藝為：初始酒精度6%vol，接種量5%，最適溫度28 ℃，搖床轉速220 r/min，培養192 h左右。

2.3 5 L發酵罐放大培養

取適量櫻桃酒，使用無菌水稀釋至酒精度6%vol，倒入發酵罐，裝液量3 500 mL，通入無菌空氣并保持攪拌。接種5%種子液，28 ℃條件下，保持通氣量0.2 L/（L·h），攪拌轉速250 r/min條件下進行培養。

結果表明，櫻桃果醋的總酸生成速率為0.49 g/（L·h），最終醋酸轉化率為79%，發酵時間為96 h。與搖床發酵相比，發酵時間縮短96 h，轉化率提高2%，說明在5 L發酵罐中，供氧方式的改變對提高醋酸菌的生長和產酸效率有著很好促進作用。醋酸菌為嚴格好氧菌，通氣量對發酵效率具有重要影響。

通過檢測發酵過程中溶氧的變化，發現發酵16 h內溶氧較高，在此之前發酵產酸速度低于0.20 g/（L·h）；16 h后溶氧開始降低，發酵36～48 h的產酸速度達到0.83 g/（L·h）；隨后逐漸維持平均速度，說明發酵0～16 h為醋酸菌生長的延滯期，主要完成菌種的適應和菌體生長，耗氧量較小，16～36 h完成菌體增殖，大量產酸，達到穩定期，可以適當調高攪拌轉速，滿足醋酸菌需求，直至發酵結束。

2.4 櫻桃果醋的有機酸種類分析

通過對櫻桃汁、櫻桃酒和櫻桃果醋進行高效液相色譜分析，發現櫻桃果醋中的有機酸為乙酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和乳酸，其中，檸檬酸、蘋果酸、乳酸在原始櫻桃中天然存在；在酵母菌發酵過程中產生少量琥珀酸，醋酸菌發酵過程主要產生的有機酸為乙酸，約占總酸量的90%。這些有機酸共同組成櫻桃果醋的主要風味成分。

3 結論

通過試驗，確定櫻桃果醋的搖床發酵最佳工藝為：初始酒精度6%vol，接種量5%，溫度28 ℃，搖床轉速220 r/min，培養192 h左右；5 L發酵罐放大培養，醋酸轉化率為79%，發酵時間為96 h；與搖床發酵相比，轉化率提高2%，發酵時間顯著縮短；通過高效液相色譜檢測，櫻桃果醋的主要有機酸成分為乙酸、檸檬酸、蘋果酸、琥珀酸和乳酸。最終發酵的櫻桃果醋酸度為4.73 g/100 mL，感官指標、理化指標及微生物指標均符合相關國家標準。得到的櫻桃果醋為呈深紅色、具有顯著的櫻桃香氣和醋香、無肉眼可見沉淀及懸浮物、無異味。初步確定櫻桃果醋的工業化生產條件，為櫻桃果醋產業化發展提供參考和借鑒。