玫瑰茄花萼超微粉總花色苷提取工藝的優化

劉國凌，郭紅輝*，劉永吉，范澤健

1. 韶關學院英東食品科學與工程學院（韶關 512005）；2. 廣東醫科大學公共衛生學院（東莞 523808）

玫瑰茄也被叫做山茄、洛神花等，學名Hibiscus sabdariffa Linn，Malvace Roselle，Roselle，是錦葵科木槿屬的一年生草本植物，有“植物紅寶石”的美譽；玫瑰茄較適合在亞熱帶以及熱帶地區種植，原產于非洲等熱帶地區，近年來在我國的東南沿海地區如福建、廣西、廣東等地有大面積種植[1]。玫瑰茄花萼中富含豐富的花色苷、分類、氨基酸、有機酸和礦物質等多種營養成分[2]。花色苷作為玫瑰茄花萼的重要活性成分之一，成為廣大學者的研究重點[3-4]。目前，已有大量研究表明玫瑰茄花萼中的花色苷具有降血壓[5]、降血脂[6-7]、抗腫瘤[8]以及抗氧化[9-10]等生理功效。而多數關于玫瑰茄花萼中總花色苷成分提取的報道[11-12]都是以玫瑰茄花萼為研究對象。

試驗以玫瑰茄花萼超微粉為研究對象，采用浸提法提取總花色，以總花色苷含量為指標，在單因素試驗的基礎上，采用響應面試驗優化玫瑰茄總花色苷提取工藝，為玫瑰茄花萼超微粉在食品工業上的應用提供了一定的理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

玫瑰茄花萼（廣東韶關）；氯化鉀（AR，天津市大茂化學試劑廠）；鹽酸（AR，衡陽市凱信化工試劑股份有限公司）；無水乙酸鈉（AR，天津市百世化工有限公司）；無水乙醇（AR，成都市科龍化工試劑廠）。

1.2 儀器與設備

DZF-6050真空干燥箱（上海一恒科學儀器有限公司）；YF2-2氣流式超微粉碎機（瑞安永歷制藥機械有限公司）；YP-B20002電子分析天平（上海光正醫療儀器有限公司）；1510酶標儀：賽默飛世爾（上海）儀器有限公司；HH-2數顯電熱恒溫水浴鍋（金壇市華峰儀器有限公司）；SK-1快速混勻器（金壇市白塔新寶儀器廠）；PHS-3E pH計（上海儀電科學儀器有限公司）；LS-POP（9）激光粒度儀（珠海歐美克儀器有限公司）。

1.3 方法

1.3.1 玫瑰茄超微粉制備

新鮮玫瑰茄花萼在60 ℃下真空干燥至水分含量小于5%，先經中藥粉碎機得粗粉后，再經超微粉碎機處理制得玫瑰茄超微粉，密封冷藏保存備用。

1.3.2 粒徑及離散度測定

參考許俊男等[13]的方法，通過激光粒度分析儀LS-POP（9）測定玫瑰茄粉粒徑并計算其離散度。

1.3.3 溶解性測定

參考凌曉等[14]的方法，測定玫瑰茄粉的溶解性。

1.3.4 花色苷吸收波長的測定

在200～800 nm下對玫瑰茄花色苷進行全波長掃描，確定其最大吸收波長。

1.3.5 花色苷含量的測定

參考Liu等[15]的方法，采用pH示差法測定玫瑰茄花色苷含量。

1.4 玫瑰茄花色苷提取工藝優化

1.4.1 單因素試驗

稱取一定量（1±0.000 2 g/份）玫瑰茄超微粉，用不同體積分數（50%，60%，70%，80%和90%）乙醇溶液以不同料液比（1∶10，1∶15，1∶20，1∶25和1∶30 g/mL）在不同的溫度（45，50，55，60和65℃）下進行浸提一段時間（60，80，100，120和140 min），離心分離得提取液，測其花色苷含量。考察乙醇體積分數、料液比、浸提溫度及浸提時間對玫瑰茄花色苷提取率的影響。

1.4.2 響應面試驗

為獲得提取玫瑰茄花萼超微粉總花色苷的最佳工藝參數，在單因素的基礎上，以花色苷含量為考察指標，以料液比、浸提溫度及浸提時間為考察因素，設計三因素三水平的響應面優化試驗，在提取溶劑體積分數一定的條件下對玫瑰茄花色苷提取工藝的其他參數進行優化。響應面試驗因素水平設計見表1。

表1 響應面試驗因素水平設計

2 結果與分析

2.1 玫瑰茄粉粒徑及離散度

由表2可以看出，經過超微粉碎后的玫瑰茄粉，粒徑減小到15.03±0.11μm（≤25 μm），符合超微粉的標準。隨著粒徑的減小，離散度也減小，表明玫瑰茄超微粉的顆粒大小分布更為均勻。

表2 玫瑰茄粉的粒徑及離散度

2.2 玫瑰茄粉溶解性

由圖1可以得知，當溫度為55 ℃時，玫瑰茄粗粉的溶解性為53.46%，超微粉的溶解性為66.85%；相較于玫瑰茄粗粉，超微粉的溶解性大大提高。這是由于同等質量的玫瑰茄粉，超微粉碎后的玫瑰茄粉粒徑更小，比表面積更大；玫瑰茄超微粉與水分更充分接觸，溶解性增大。

圖1 55 ℃時玫瑰茄粗粉、超微粉的溶解性對比

2.3 最大吸收波長的確定

由圖2可見，玫瑰茄花色苷在270和520 nm處均存在吸收峰，符合在278 nm處附近和507～536 nm處范圍內的花色苷特征吸收[16]，因此在可見光區選取520 nm作為玫瑰茄花色苷的最大吸收波長。

2.4 單因素試驗結果與分析

2.4.1 乙醇體積分數對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在料液比1∶20（g/mL）、提取溫度55 ℃、提取時間100 min的條件下，分別測定用不同體積分數的乙醇提取出的玫瑰茄超微粉總花色苷含量，結果見圖3。隨著乙醇體積分數的增大，提取液中的玫瑰茄花色苷含量顯著增大，在70%乙醇體積分數下達到最大值723.94 mg/100 g；乙醇體積分數超過70%后，溶液極性減弱，導致極性較強的花色苷含量減少，這與任順成等[17]的研究結果一致。因此，確定70%為提取玫瑰茄花色苷的最佳提取體積分數，在后續的試驗中均采用這一體積分數。

圖2 玫瑰茄花色苷紫外-可見光譜圖

圖3 乙醇體積分數對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.4.2 料液比對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

由圖4可見，隨著料液比的變化，70%乙醇在55℃下以不同的料液比浸提玫瑰茄超微粉100 min后所得到的玫瑰茄總花色苷含量呈現先增大后減小的趨勢，當料液比為1∶20（g/mL）時達到峰值725.16 mg/100 g。曾哲靈等[18]在其研究中指出，當料液比為1∶20～1∶25（g/mL）時，玫瑰茄花色苷含量最大，這與此次試驗研究結果相靠近；當料液比過小時，浸提溶液過少，導致玫瑰茄中的花色苷無法被充分浸提；當料液比過大時，浸提溶液體積過多，玫瑰茄花色苷分子間作用力減小，穩定性下降而分解，含量減小。

2.4.3 溫度對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在乙醇體積分數70%、料液比1∶20（g/mL）、提取時間100 min的條件下，分別測定用不同溫度提取出的玫瑰茄超微粉總花色苷的含量，結果見圖5。提取溫度的升高促進玫瑰茄花色苷的釋放，提取出的玫瑰茄總花色苷含量也不斷增加，并在55 ℃時達到最高值（724.97 mg/100 g）。之后由于溫度過高，花色苷的結構受破壞而發生降解，含量呈現下降趨勢。

圖4 料液比對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

圖5 溫度對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.4.4 時間對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

在乙醇體積分數70%、料液比1∶20（g/mL）、浸提溫度55 ℃的條件下，分別測定不同提取時間下玫瑰茄超微粉總花色苷含量，結果見圖6。隨著浸提時間的不斷延長，玫瑰茄花色苷含量先增大后減小，在100 min時花色苷釋放量達到最大值。但長時間的浸提導致花色苷發生降解，總花色苷含量減小。

圖6 時間對提取玫瑰茄花色苷效果的影響

2.5 響應面試驗結果與分析

2.5.1 響應面試驗結果及數值分析

在單因素試驗的基礎上進行響應面Box-Behnken Design試驗，以70%乙醇溶液，對自變量料液比、浸提溫度、浸提時間組成的三因素三水平17個試驗點進行花色苷含量的測定，結果見表3。

以一次浸提液中的玫瑰茄花色苷含量為響應值，利用Design Expert 8.0軟件對表3中數據進行回歸擬合，得到料液比、浸提溫度、浸提時間對玫瑰茄花色苷含量影響的回歸模型方程：

Y=729.41+10.33A-3.03B+0.42C+1.88AB-0.42AC-0.83BC-33.33A2-14.13B2-14.76C2

表3 響應面試驗結果

表4 回歸模型方差分析

進一步對回歸模型進行方差分析，其結果見表4。響應面試驗的回歸模型p=0.002 8＜0.01，模型達到高度顯著的水平。該模型的回歸系數R2=0.930 0，表明93%的數據均可以用此回歸模型方程解釋。失擬相p=0.756 9＞0.05，表明該回歸模型失擬不顯著，擬合程度良好。試驗因素對70%乙醇溶液提取玫瑰茄超微粉中花色苷的影響順序為A（料液比）＞B（浸提溫度）＞C（浸提時間）；回歸模型中A2對玫瑰茄花色苷含量的影響高度顯著（p＜0.01），A、B2、C2影響顯著（p＜0.05），AB、AC、BC影響不顯著（p＞0.05），表明3個因素之間的交互作用不明顯且對玫瑰茄花色苷含量的影響存在曲面效應。

2.5.2 各因素交互作用對總花色苷含量的影響

利用Design Expert 8.0軟件擬合得到響應曲面及等高線圖，如圖7～圖9所示。料液比和浸提溫度、料液比和浸提時間對玫瑰茄花色苷含量影響的響應曲面陡峭程度不明顯，浸提溫度和浸提時間對玫瑰茄花色苷含量影響的響應曲面平緩，所投射的等高線圖也均趨于圓形，表明料液比、浸提溫度、浸提時間3個因素之間的交互作用均不顯著；當浸提溫度較小、浸提時間較短時，料液比對響應值的影響較大，在料液比1∶21（g/mL）后，隨著料液比的增加，曲面彎曲程度減緩，花色苷含量趨于穩定；浸提溫度和浸提時間對提取玫瑰茄超微粉中的花色苷影響不如料液比，與方差分析結果一致，證明試驗模型的可靠性。

圖7 料液比和浸提溫度對玫瑰茄花色苷含量影響的響應曲面

圖8 料液比和浸提時間對玫瑰茄花色苷含量影響的響應曲面

圖9 溫度和時間對玫瑰茄花色苷含量影響的響應曲面

2.5.3 響應面優化與驗證

利用Design Expert 8.0軟件對試驗模型進行優化，得到玫瑰茄超微粉中花色苷的最佳提取工藝條件：料液比1∶20.76（g/mL）、浸提溫度54.03 ℃、浸提時間100.28 min。此時，花色苷含量預測值為730.34 mg/100 g。為了便于驗證試驗的進行，將最優提取工藝條件調整為料液比1∶21（g/mL）、浸提溫度54 ℃、浸提時間101 min。在該工藝條件下平行3次驗證試驗，測得玫瑰茄花色苷含量為729.68 mg/100 g，與理論值基本吻合，表明模型的可靠度較高。

3 結論

超微粉碎后的玫瑰茄花萼超微粉粒徑減小到25 μm以下，相比于普通粉碎后的玫瑰茄粉，其顆粒大小分布均勻，成色更亮，花萼細胞破壁率增加，溶解性增大，同等條件下花色苷釋放量增大。在單因素試驗基礎上結合響應面BBD試驗優化玫瑰茄花色苷的提取工藝，通過試驗模型得知，影響玫瑰茄花色苷含量的主要因素是料液比，次要因素是浸提溫度和浸提時間。驗證后的玫瑰茄花色苷最優提取工藝條件為料液比1∶21（g/mL）、浸提溫度54 ℃、浸提時間101 min，玫瑰茄花色苷含量為729.68 mg/100 g，比普通采用玫瑰茄花萼為原料提取所得的總花色苷含量要高得多[19-20]。進一步表明超微粉碎對花色苷的釋放具有促進作用，且結合響應面分析法，能夠很好地優化玫瑰茄花色苷的提取工藝，為玫瑰茄花萼超微粉的開發利用提供一定的理論依據。