響應(yīng)面法優(yōu)化纖維素酶輔助提取蛹蟲草中蟲草素工藝

陸巖，陸丹丹，劉瑞月，肖佳，宮曉范，甄宗圓 *

1. 安徽科技學院食品藥品學院（鳳陽 233100）；2. 棗莊學院食品科學與制藥工程學院（棗莊 277160）

蛹蟲草屬于子囊菌門中的蟲草屬，亦名北蟲草[1]，是鱗翅目昆蟲的蛹被真菌寄生而形成復(fù)合體包括子座和菌核，在中國華北、西南等地區(qū)都有生長[2]。蛹蟲草中含有多種生物有效成分，如蟲草多糖和蟲草素等，人工蛹蟲草質(zhì)量可以用蟲草素含量衡量[3-4]。蟲草素具有多種藥理作用，如抗氧化[5]、抗癌[6-8]等。外國學者通過研究發(fā)現(xiàn)蟲草素能有效降低大鼠磨損模型的黏附力，其在醫(yī)藥及保健品行業(yè)有廣泛應(yīng)用[9-10]，所以提高其提取率亟待解決。為提高其產(chǎn)率，在培養(yǎng)條件上加以優(yōu)化[11]，研究表明低氧條件更適合于液體表面培養(yǎng)中蟲草素的生產(chǎn)[12]，也有研究在生物合成途徑分析基礎(chǔ)上，通過代謝調(diào)控提高蟲草素和蟲草酸的產(chǎn)量[13]。另外，溶解性較好的蟲草素制劑被應(yīng)用于臨床[14]，蟲草素納米粒還可作為蟲草素緩釋劑的載體，為治療肺癌提供一種有效材料[8]。

蟲草素提取方法有加速溶劑萃取法、微波輔助乙醇/硫酸銨雙水相提取等[15-16]，但關(guān)于采用纖維素酶提高蛹蟲草中蟲草素得率的報道很少見。酶解技術(shù)是利用酶能降解細胞壁中的一些物質(zhì)，破壞植物細胞的細胞壁，使植物細胞壁中的生物活性物質(zhì)流出。以蛹蟲草為原料，采用纖維素酶輔助單因素試驗，研究提取時間、酶添加量、pH、提取溫度對蟲草素提取率的影響，在此基礎(chǔ)上，通過響應(yīng)面分析4種因素及其相互作用對蟲草素含量的影響，最終得到蟲草素的最佳提取方法，為提取蛹蟲草中蟲草素的工業(yè)化生產(chǎn)提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

蛹蟲草（福建省古田縣大豐工貿(mào)有限公司），罐裝密封備用、蟲草素標準品（CAS 73-03-0，上海聯(lián)邁生物工程有限公司）、維素酶（≥50 000 U/g，產(chǎn)品編號RY01008，江蘇銳陽生物科技有限公司）；甲醇（色譜純）；其余化學試劑（分析純）；蒸餾水和超純水（18.2 MΩ·cm、25 ℃）。

1.2 儀器與設(shè)備

Agilent 1290超高液相色譜儀，色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，3.5 μm，美國安捷倫公司）；KS-300 Ei型超聲波清洗器（寧波海曙科生超聲設(shè)備有限公司）；YP 100001和FA 1104電子天平（上海越平科學儀器有限公司）；HH-S6數(shù)顯恒溫水浴鍋（常州普天儀器制造有限公司）；PHS-3C型PH計（上海儀電科學儀器股份有限公司）；DUG-92464型電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；WHY-2型數(shù)顯水浴恒溫振蕩（常州普天儀器制造有限公司）；DFY-250型250 g搖擺式高速萬能粉碎機（溫嶺市林大機械有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鞏義市予華儀器有限責任公司）。

1.3 試驗方法

1.3.1 蟲草素提取工藝流程及操作要點

蛹蟲草子實體→干燥→粉碎→稱取2.00 g→加水70 mL→加酶量2%→調(diào)pH 5→水浴振蕩酶解浸提→靜置→取上清液→定容稀釋→0.22 mm濾膜過濾除雜→蟲草素待測液

1) 蛹蟲草子實體從密封包裝中取出，使用85 ℃，烘干2 h，放入干燥器中冷卻至室溫。

2) 水浴振蕩法浸提。將子實體粉末與水混勻后于50 ℃下進行水浴振蕩浸提120 min。

3) 酶種類及酶添加量的選擇。添加纖維素酶含量2%。

4) 靜置。將浸提后的酶解液于冰水中冷卻靜置5 min。

5) 0.22 mm濾膜微濾條件。操作壓力0.12 MPa，操作溫度10 ℃。

1.3.2 蟲草素測定

1.3.2.1 UPLC測定蟲草素含量條件的確定

參考文獻[17]確定合適的色譜條件：流動相，甲醇-水（15∶85，V/V）；檢測波長260 nm；流速0.5 mL/min；進樣量10 mL，室溫；色譜柱Agilent ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×150 mm，3.5 μm）。

1.3.2.2 標準品的配制

精密稱取蟲草素標準品20 mg于50 mL干凈燒杯中溶解并轉(zhuǎn)移定容至100 mL容量瓶中，得到原溶液，依次用超純水稀釋成0.01，0.02，0.03，0.04和0.05 mg/mL質(zhì)量濃度的標準品溶液，備用。

1.3.3 蟲草素提取率的計算

式中：M1為依據(jù)標準曲線計算出的被測液中蟲草素質(zhì)量，mg；M2為稱取的子實體粉末質(zhì)量，g；V1為待測液分取的體積，mL；V2為待測液的總體積，mL。

1.4 蛹蟲草子實體中提取蟲草素的單因素試驗

1.4.1 最適提取時間的篩選

準確稱取干燥后的子實體粉末2.00 g于100 mL錐形瓶中，加水70 mL，調(diào)節(jié)pH 5，加纖維素酶量2%，混勻，用保鮮膜封口后于50 ℃下分別酶解60，90，120，150和180 min，共5組，每組3個平行，時間結(jié)束后立即冷卻，靜置，取上清液量其體積，按1.3.2的方法測定蟲草素含量，并計算蟲草素提取率，確定最適提取時間。

1.4.2 最適酶添加量的篩選

準確稱取干燥后的子實體粉末2.00 g于100 mL錐形瓶中，加水70 mL，調(diào)節(jié)pH 5，分別加纖維素酶量為0，1.5%，2.0%和2.5%，混勻，用保鮮膜封口后于50 ℃下酶解120 min，共4組，每組3個平行，時間結(jié)束后立即冷卻，靜置，取上清液量其體積，按1.3.2的方法測定蟲草素含量，并計算蟲草素提取率，確定最適酶添加量。

1.4.3 最適酶pH的篩選

準確稱取干燥后的子實體粉末2.00 g于100 mL錐形瓶中，加水70 mL，分別調(diào)節(jié)pH 4.0，4.5，5.0和5.5，加纖維素酶量2%，混勻，用保鮮膜封口后于50℃下酶解120 min，共4組，每組3個平行，時間結(jié)束后立即冷卻，靜置，取上清液量其體積，按1.3.2的方法測定蟲草素含量，并計算蟲草素提取率，確定最適酶pH。

1.4.4 最適提取溫度的篩選

準確稱取干燥后的子實體粉末2.00 g于100 mL錐形瓶中，加水70 mL，調(diào)節(jié)pH 5，加纖維素酶量2%，混勻，用保鮮膜封口后分別于30，40，50和60 ℃酶解120 min，共4組，每組3個平行，時間結(jié)束后立即冷卻，靜置，取上清液量其體積，按1.3.2的方法測定蟲草素含量，并計算蟲草素提取率，確定最適提取溫度。

1.5 響應(yīng)面試驗設(shè)計

在單因素試驗基礎(chǔ)上，依據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選取提取時間（X1）、酶添加量（X2）、pH（X3）和提取溫度（X4）為4個考察因素，蟲草素提取率（Y）為響應(yīng)值，進行四因素三水平的試驗設(shè)計，確定蛹蟲草中蟲草素最佳提取工藝條件。

2 結(jié)果與分析

2.1 標準曲線的繪制

在1.3.2.1的色譜條件下測定蟲草素標準品及樣品，其結(jié)果顯示兩者時間基本吻合，并且能夠和周邊物質(zhì)分離開。標準品液相色譜圖如圖1所示，樣品液相色譜圖如圖2所示。

圖1 標準品液相色譜圖

圖2 樣品液相色譜圖

利用UPLC在1.3.2.1的色譜條件下測定制備的標準溶液，分析得回歸方程為y=69 778x+19.663，R2=0.999 8。標準品曲線圖見圖3。

圖3 標準曲線

2.2 單因素試驗結(jié)果

2.2.1 提取時間對蛹蟲草子實體中蟲草素提取率的影響結(jié)果如圖4所示，隨提取時間推移，蟲草素提取率先上升后下降，提取率最高時，提取時間為120 min，故最佳提取時間為120 min。

圖4 提取時間對蟲草素的影響

2.2.2 酶添加量對蛹蟲草子實體中蟲草素提取率的影響

結(jié)果見圖5，隨酶添加量增加，蟲草素提取率先增加后減少，提取率最高時，酶添加量為2%，故最佳酶添加量為2%。

圖5 酶添加量對蟲草素的影響

2.2.3 酶pH對蛹蟲草子實體中蟲草素提取率的影響

結(jié)果見圖6，隨著pH增大，蟲草素提取率先升高后下降，提取率最高時pH為4.5，故最佳pH 4.5。

2.2.4 提取溫度對蛹蟲草子實體中蟲草素提取率的影響

結(jié)果如圖7所示，隨提取溫度升高，蟲草素提取率先上升后下降，提取率最高時，提取溫度為50 ℃，故最佳提取溫度為50 ℃。

圖6 pH對蟲草素的影響

圖7 提取溫度對蟲草素的影響

2.3 響應(yīng)面試驗結(jié)果

在分析單因素結(jié)果后，利用Box-Behnken試驗設(shè)計原理，選擇提取時間（A）、酶添加量（B）、pH（C）、提取溫度（D）為因素，并分別選取低、中、高3個水平得到四因素三水平的因素水平表，見表1，并以蟲草素提取率（Y）為響應(yīng)值，試驗方案設(shè)計和結(jié)果見表2。

運用Design-Expert 8.0.6對試驗結(jié)果進行回歸擬合，得到回歸方程為：Y=0.17+2.875E-003A+3.942E-003B-4.275E-003BC-8.260E-003A2-7.435E-003C2。

運用Design-Expert 8.0.6對其結(jié)果進行分析，方差分析結(jié)果見表3，驗證回歸方程的有效性。對其可信度進行分析，其模型的R2=0.838 4，接近于1，變異系數(shù)（C.V.%）為2.48，說明模型的擬合程度和置信度都較好。方差分析后，模型的F=5.19，對應(yīng)的p=0.002＜0.01，表明模型極顯著；方程失擬項的F=2.2，對應(yīng)的概率p=0.233＞0.05，表明失擬項不顯著，回歸模型與實際值的擬合程度較好。

由結(jié)果可知，時間（A2，p＜0.000 2）、酶添加量（B，p=0.003 6＜0.01））、pH（C2，p=0.000 3＜0.01）等對蟲草素提取率的有極顯著的影響，時間（A，p=0.023 2＜0.05）、酶添加量與pH的交互作用（BC，p=0.046 1＜0.05）對蟲草素提取率有顯著的影響，時間、pH、酶添加量、酶添加量與pH交互作用對蟲草素提取率的影響逐漸減小。

觀察圖8～圖10，可以直觀反映各因素其交互作用對響應(yīng)值Y的影響結(jié)果。利用模型擬合出響應(yīng)值對應(yīng)的響應(yīng)面三維圖形，三維空間圖形有助于各個因素之間交互作用的研究[18]。等高線呈現(xiàn)橢圓形狀時表示顯著，否則相反，所以憑借對等高線外觀的觀察，可以反映各個因素之間交互作用大小[3]。響應(yīng)面坡度越陡，表明因素對綜合得率的影響越大，否則相反[19]。由圖8可以看出，隨著酶添加量和提取時間增大，蟲草素提取率先上升后下降，隨著時間推移，蟲草素提取率升高和下降均明顯，由此判斷時間對其的影響較顯著，但兩者交互作用不顯著。由圖9可以看出，隨提取時間和pH增加，提取率先上升后下降，且隨著時間推移，蟲草素提取率的變化較明顯，所以時間對其的影響較大，但兩者交互作用不顯著。由圖10可以看出，響應(yīng)面的曲面陡峭，隨pH和酶添加量的增大，提取率先升后降，兩者交互作用顯著。

表1 Box-Behnken試驗因素水平表

表2 Box-Behnken試驗設(shè)計及結(jié)果

表3 方差分析

圖8 提取時間和酶添加量對蟲草素提取率影響的等值線和響應(yīng)面

圖9 提取時間和pH對蟲草素提取率影響的等值線和響應(yīng)面

圖10 酶添加量和pH對蟲草素提取率影響的等值線和響應(yīng)面

2.4 提取工藝的優(yōu)化及驗證

利用響應(yīng)面分析，蟲草素最佳提取方法為：時間123.84 min，酶添加量2.50%，pH 4.36，溫度40 ℃。在此預(yù)測條件下，蟲草素提取率為0.170 5%。因其預(yù)測條件下所得提取率低于試驗設(shè)計中的第4組，又因條件相似，所以提取最優(yōu)工藝為：時間120 min，酶添加量2.5%，pH 4.5，溫度40 ℃，在此條件下提取率為0.174 5%。經(jīng)過3次重復(fù)試驗，得到平均值為0.172 6%，略低于0.174 5%，表明確定的最優(yōu)工藝條件穩(wěn)定可靠。

3 討論

經(jīng)查閱文獻，蟲草的品種不同，蟲草素提取率也不同，如蟲草1、蟲草2、蟲草3等3個不同品種的蟲草，其蟲草素提取率依次為0.159 2%，0.108 8%和0.018 4%[20]。蟲草素可以通過不同人工培養(yǎng)方法進行生物合成，包括固體基質(zhì)發(fā)酵和液體培養(yǎng)等[9]，由于不同菌株的培養(yǎng)對蛹蟲草人工子實體含量影響極大，所以不同品種的蛹蟲草中的蟲草素含量差距會很大[21]，另外不同生長期對應(yīng)的蟲草素含量也不同，有研究利用氣相色譜質(zhì)譜（GC-MS）分析發(fā)現(xiàn)蛹蟲草衰老期（第4階段）蟲草素顯著富集[22]。試驗結(jié)果與其他文獻中結(jié)果存在差異。有研究通過UPLC-MS/MS檢測蟲草素，并取得良好效果，但是方法通常用于測定少量標記化合物濃度[23]。另外有研究建立快速、可靠、重現(xiàn)性好的超高效液相色譜-質(zhì)譜法（UPLC-IMS）對麥冬的8種包括蟲草素在內(nèi)的天然核苷進行檢測[24]。由于UPLC法有操作簡單、高效快速、價廉、能夠有效分離所要物質(zhì)的特點[25]，所以運用UPLC法對蟲草素含量進行檢測。

4 結(jié)論

利用響應(yīng)面分析中Box-Behnken試驗設(shè)計方法對試驗結(jié)果進行分析，所得回歸方程為Y=0.17+2.875E-003A+3.942E-003B-4.275E-003BC-8.260E-003A2-7.435E-003C2。纖維素酶輔助提取蟲草素的最佳工藝條件為：提取時間120 min，酶添加量2.5%，pH 4.5，溫度40 ℃。在此條件下蟲草素的提取率為0.172 6%。試驗結(jié)果與回歸方程得到的最優(yōu)得率相近，說明此工藝可行。