微生物復合發酵劑對香腸的食用安全性分析

田甜，張雅琳，潘攀，孫勁松，王新惠*，劉洋

1. 成都農業科技職業學院（成都 611130）；2. 成都大學肉類加工四川省重點實驗室（成都 610106）

香腸具有悠久的歷史，中國傳統的香腸依靠的是自然環境中的微生物進行發酵，而在德國、意大利等國家制作的香腸是有添加微生物發酵劑，并且發酵香腸較傳統香腸具有較高質量。近幾年，香腸作為消費者喜愛的發酵食品，其食用安全性受到關注，因為在自然發酵環境中會有某些有害微生物會產生有害物質，從而對人體健康造成傷害，如組胺會導致人體產生暈厥、嘔吐等急性中毒癥狀，殘留的亞硝酸鹽可以和胺類物質生成亞硝胺，從而誘發胃部等發生癌變。研究學者發現通過添加微生物發酵劑，不僅可以改善香腸的品質，還可以提高香腸的安全性，李婧等[1]在香腸中接種清酒乳桿菌（Lactobacillus sakei），發現香腸的感官性提高，并且有害物質減少；Corral等[2]發現接種漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）可以彌補因為低鹽低脂給香腸帶來的感官上的缺點。Cavicchioli等[3]和孫燕菲等[4]發現戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）在發酵食品中能抑制金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）和單核細胞李斯特菌（Listeria monocytogenes）等有害微生物的生長。

試驗加入復合發酵劑，由清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成，并且由自然發酵的香腸作為對照組進行對比，研究復合發酵劑對香腸的理化指標和安全性指標的影響，旨在為提高傳統香腸的食用安全性提供理論基礎。

1 材料與方法

1.1 原輔料

衛生檢疫合格的新鮮豬肉、腸衣、食用級食鹽、味精、蔗糖等均購于成都龍泉驛區成都大學十陵鑫大百貨超市。

1.2 復合發酵劑

清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）和肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）均由肉類加工四川省重點實驗室從自然發酵的香腸中分離獲得，5種菌以1∶1∶1∶1∶1比例制作成凍干粉。

1.3 主要試劑

磷酸組胺標準品和衍生劑丹磺酰氯（Sigma公司）；乙腈（Bessldorf公司）；正丁醇、甲醇、三氯甲烷、乙酸、乙酸銨、丙酮、三氯乙酸、氫氧化鈉、乙醚、氯化鈉、鹽酸、亞硝酸鈉、谷氨酸鈉、亞鐵氰化鉀、氫氧化鉀、酚酞、乙醇、乙酸鋅、對氨基苯磺酸等（均為國產分析純，成都市科隆化學品有限公司）。

1.4 主要儀器與設備

Testo 205肉類專用pH計（德國儀表國際貿易（上海）有限公司）；JA3103N電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；RC-III-20L超純水機（成都瑞昌儀器制造有限公司）；HD-3A型智能水分活度儀（無錫市華科儀器儀表有限公司）；DZKW-4電子恒溫水浴鍋（北京中興偉業儀器有限公司）；721可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）；LD-5離心機（江蘇省金壇市榮華儀器制造有限公司）。

1.5 香腸制作

1.5.1 香腸配方

瘦肉與肥肉比例為3∶1，其他輔料比重按照肉的質量為蔗糖0.3%、鹽2.6%、水5%、葡萄糖0.4%、NaNO2150 mg/kg、抗壞血酸（維生素C）0.06%、添加復合發酵劑0.04%，不添加其他香辛料。

1.5.2 工藝流程

原料肉→修整→腌制→絞碎→拌料→灌腸→發酵→成熟

1.5.3 操作要點

將豬肉切成1.5～2.0 mm左右同樣大小的肉丁，將切好的肉丁在冰箱冷藏室（3～7 ℃）冷藏24 h，加入調料，混合均勻后在低溫下腌制24 h；直投入凍干復合發酵劑，接種量0.04%，采用手工灌腸，每節香腸約10 cm，用針扎香腸中氣泡；灌好的香腸掛放在恒溫恒濕發酵箱中，控制發酵溫度在20～25 ℃之間，相對濕度在91%～96%之間，進行發酵3 d，控制溫度在16～18 ℃之間，相對濕度在75%～80%之間，直到香腸成熟，以自然發酵為對照。

1.6 試驗方法

1.6.1 pH的測定

采用德國Testo 205 pH計肉類專用穿刺電極插入香腸前、中、后部，重復測定3次，取平均值。

1.6.2AW值的測定

取香腸前、中、后3部分的肉進行切碎，并且混勻，每次稱取5 g肉平鋪在水分活度儀測定盒的底部，稱定3次，取平均值。

1.6.3 酸價的測定

參照GB/T 5009.37《食用植物油衛生標準的分析方法》[5]測定香腸中的酸價。

1.6.4 亞硝酸鹽的測定

依據GB/T 5009.33—2011[6]的方法測定香腸中亞硝酸鹽含量。

1.6.5 組胺的測定

參考王新惠等[7]的方法測定香腸中的組胺含量。

1.7 數據分析

每個樣品做3次平行檢測。數據分析采用Matlabver.2006b和Microsoft Excel。所有數據由平均值±標準偏差組成。

2 結果與分析

2.1 復合發酵劑對香腸pH的影響

自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的pH隨著時間變化如圖1所示。結果表明，自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的pH隨著時間先降低后升高，最后再降低。在發酵初期，接種復合發酵劑香腸的pH下降的速度和時間比對照組快，是因為復合發酵劑中有戊糖片球菌和清酒乳酸桿菌，可以利用碳水化合物產生大量乳酸[8]，發酵環境中的微生物發酵劑在前期快速增長，所以導致發酵環境的pH迅速下降。在發酵后期，自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的pH均有所上升，可能的原因是低pH發酵環境雖然會抑制有害微生物增長，但是也會影響乳酸菌代謝，并且發酵環境中的蛋白質分解生成的堿性物質對發酵環境的酸有一定緩沖作用，所以發酵環境中的pH有短暫上升趨勢。

從圖1可知，在第18天時，自然發酵香腸的pH 5.34，而接種復合發酵劑香腸的pH 5.14，接種復合發酵劑香腸的pH比自然發酵香腸的pH低3.75%。pH是屬于防止食品腐敗的柵欄因子，在傳統香腸中檢測出有發光桿菌屬（Photobacteriumspp.）、環絲菌屬（Brochothrixspp.）和假單胞菌屬（Pseudomonasspp.）等幾種腐敗菌屬[9]，所以降低香腸的pH不僅可以抑制腐敗菌生長，也可以降低發酵環境中酶活性，有利于提高香腸的食用安全性、增長其貯藏期。

圖1 復合發酵劑對香腸pH的影響

2.2 復合發酵劑對香腸AW的影響

自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的AW值隨著發酵時間變化如圖2所示。自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的AW值均隨著時間而降低，在發酵后期，接種復合發酵劑香腸的AW值比自然發酵香腸降得更低，Nie等[10]和Aro等[11]發現戊糖片球菌、清酒乳桿菌和肉葡萄球菌可以加強蛋白酶活性，從而加強蛋白質的水解，蛋白質結構被破壞，導致蛋白質的保水性降低，所以接種復合發酵劑香腸的AW值低于自然發酵香腸的AW值。

從圖2可以看出，在第18天時，自然發酵香腸的AW值是0.828，而接種復合發酵劑香腸的AW值是0.806，接種復合發酵劑香腸的AW值比自然發酵香腸低2.66%，發酵環境中的AW值的降低不僅會影響許多腐敗菌的生長[12]，并且還可以影響許多需要水參與的生化反應。生活中的面粉、奶粉等產品就是依靠降低AW值而增加貯藏期和抑制有害微生物生長，從而提高食用安全性，可見AW值對食品保藏和食品安全的重要性。結果表明，對香腸添加復合發酵劑會提高香腸的微生物安全性。

圖2 復合發酵劑對香腸AW的影響

2.3 復合發酵劑對香腸酸價的影響

自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的酸價隨著發酵時間變化如圖3所示。結果表明，試驗組和對照組的酸價均隨著時間而增加，但是接種復合發酵劑的香腸酸價始終低于自然發酵的香腸。脂肪的氧化分為2步，第1步是脂肪的水解過程，脂肪水解成游離的脂肪酸，第2步是脂肪酸被氧化成醛、酮等小分子物質，而香腸的風味主要來源于這些酯、酮分子。在復合發酵中的漢遜德巴利酵母能加強香腸的風味，可以產生酯、醇和酮類等風味物質，并且研究發現，漢遜德巴利酵母也可以抑制香腸的氧化和酸敗[13]。復合發酵劑中的肉葡萄球菌和木糖葡萄球菌能幫助香腸產生良好風味[14]。香腸適度的脂肪氧化能帶來風味，但是氧化過度，不僅會影響香腸感官，也會造成食物浪費。

從圖3可以看出，自然發酵香腸在發酵結束時酸價是1.41 mg/kg，而接種復合發酵劑香腸在發酵結束時酸價是1.34 mg/kg，接種復合發酵劑香腸酸價比自然發酵香腸的酸價低4.96%。因此，添加復合發酵劑可以降低香腸的過度氧化情況出現，并且可以賦予香腸良好風味。

圖3 復合發酵劑對香腸酸價的影響

2.4 復合發酵劑對香腸亞硝酸鹽殘留量的影響

自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸中的亞硝酸鹽殘留量隨著發酵時間變化如圖4所示。結果表明，2種香腸的亞硝酸鹽殘留量均先升高后再降低。在第8天時，2種香腸的亞硝酸鹽殘留量達到最大值，剛開始亞硝酸鹽的殘留升高的原因可能是整個發酵環境都是在開放環境，在起始的發酵環境中由于菌群結構復雜，雜菌也會很多，所以發酵環境中的雜菌將硝酸鹽轉化成亞硝酸鹽，香腸中亞硝酸鹽的殘留量是呈增加的趨勢。在后期，亞硝酸鹽的殘留量降低的原因可能是環境中pH下降，抑制雜菌代謝，并且亞硝酸鹽在酸性條件下可以生成亞硝酸，從而與肌紅蛋白反應，最后發酵環境中的亞硝酸鹽的殘留量降低。復合發酵劑中的清酒乳酸桿菌可以降低亞硝酸鹽的殘留[15]，有研究學者發現木糖葡萄球菌的過氧化氫酶能將亞硝酸鹽分解成為氨[16]。所以在發酵后期，香腸中的亞硝酸鹽殘留量降低，并且添加復合發酵劑香腸的亞硝酸鹽殘留量低于自然發酵香腸。

從圖4可知，自然發酵香腸最后的亞硝酸鹽殘留量是1.56 mg/kg，而接種復合發酵劑香腸亞硝酸鹽殘留量是1.08 mg/kg，接種復合發酵劑香腸亞硝酸鹽殘留量比自然發酵香腸低30.77%。亞硝酸鹽因為具有抑菌、抗氧化和著色等功能被廣泛使用，但是亞硝酸鹽能和次級胺生成亞硝胺，亞硝胺會誘發癌癥，尤其是在胃部[17]。可以看出，添加復合發酵劑可以降低亞硝酸鹽在香腸中的殘留量，有利于提高香腸的食用安全性。

2.5 復合發酵劑對香腸組胺含量的影響

自然發酵香腸和接種復合發酵劑香腸的組胺含量隨發酵時間變化如圖5所示。結果表明，自然發酵和接種復合發酵劑香腸的組胺含量均為先升高后降低。組胺的形成必須要有前體物質，游離的組氨基酸，還必須要有能產生氨基酸脫羧酶的微生物，研究學者在香腸、調味品以及魚肉等產品中均發現組胺的存在[18-19]。初始階段，香腸內組胺含量升高，可能是因為發酵環境中菌群較復雜，再加上香腸富含蛋白質，蛋白質分解產生游離的組氨基酸，發酵環境中的雜菌產生組氨基酸脫羧酶作用于組氨基酸，所以前期的組胺含量快速增長。但在后期，因為乳酸菌增長，導致發酵環境pH下降，影響氨基酸脫羧酶的活性和雜菌的生長代謝，所以組胺增長得到抑制，并且香腸中有許多微生物可以產生組胺降解酶而減少組胺含量。復合發酵中的清酒乳酸桿菌和木糖葡萄糖球菌可以降低香腸中的組胺[20]，所以在后期，添加復合發酵劑香腸中的組胺含量會低于自然發酵香腸。

從圖5可知，自然發酵香腸在發酵結束時組胺含量為1.72 mg/kg，接種復合發酵劑香腸在發酵結束時組胺含量是1.43 mg/kg，接種香腸比自然發酵香腸的組胺含量低16.86%。組胺是生物胺中危害性較強的，并且在發酵食品中組胺是常見生物胺，結果表明，在香腸中添加復合發酵劑可以減少組胺生成，提高香腸的食用安全性。

圖4 復合發酵劑對香腸亞硝酸鹽含量的影響

圖5 復合發酵劑對香腸組胺含量的影響

3 結論

近幾年，頻發的食品問題將食品安全推向風口浪尖，香腸作為中國傳統的發酵食品，深受消費者喜愛，試驗在制作香腸過程中，添加由清酒乳酸桿菌（Lactobacillus sakei）、戊糖片球菌（Pediococcus pentosaceus）、木糖葡萄球菌（Staphylococcus xylosus）、漢遜德巴利酵母（Debaryomyces hansenii）、肉葡萄球菌（Staphylococcus carnosus）制成的復合發酵劑，結果發現，添加復合發酵劑的香腸在pH和AW比自然發酵的香腸低3.75%和2.66%；減少香腸中有害物質組胺和亞硝酸鹽含量，在發酵結束時，復合發酵香腸的組胺和亞硝酸鹽含量分別是1.43和1.08 mg/kg，比自然發酵香腸低16.86%和30.77%；并且能增強香腸風味，延緩香腸氧化，復合發酵香腸的酸價是1.34 mg/kg，比自然發酵香腸的酸價低4.96%。

有研究學者通過在傳統香腸中接種單一的發酵劑來提高香腸的食用安全性，但無法彌補因為提高安全性而帶來的風味和感官上的缺失。試驗采用復合發酵劑，能保證香腸品質且提高食用安全性，試驗旨在改善香腸傳統工藝，為廣大消費者提供風味獨特及安全的發酵食品。